زمان دقیق شناسایی آفلاتوکسین‌ها مشخص نشده است، اما به طور یقین، زمان آن به قبل از سال 1960 مربوط می‌شود. به دنبال مسمومیت اتفاقی در بسیاری از گونه‌های حیوانی و در نتیجه مطالعات در این زمینه، بشر برای اولین‌بار به وجود آنها پی برد. در واقع با پی بردن به ارزش غذایی دانه‌های روغنی، برای تغذیه دام و انتقال این مواد از مناطق معتدله و اضافه کردن آنها به جیره غذایی حیوان، این مسمومیت‌ها به وقوع پیوست. در میان مایکوتوکسین‌ها، آفلاتوکسین‌ها مهمترین آنها هستند و بیماری‌های ناشی از تغذیه مواد آلوده به آفلاتوکسین، خطرات قابل ملاحظه‌ای را برای انسان، دام و طیور به همراه دارد. آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس دو گونه مهم تولیدکننده آفلاتوکسین، در بین گونه‌های مختلف آسپرژیلوس‌ها هستند این دو قارچ به عنوان یک عامل مولد فساد در فرآورده‌های انباری به حساب می‌ایند. (49، 41، 11).
خصوصیات فیزیکی و شیمیایی و مراحل بیوسنتز بعضی از آفلاتوکسین‌ها و متابولیت‌های آنها در جدول (4-1) و شکل (4-1) خلاصه شده است شکل (4-1): مراحل بیوسنتز آفلاتوکسین‌ها (49، 41، 11) جدول (4-1): خصوصیات فیزیکی و شیمیایی آفلاتوکسین‌ها و متابولیت‌های آنها آفلاتوکسین، فرمول مولکولی، وزن مولکولی، نقطه ذوب، جذب UV، نشر فلورسنس nm nm265 nm362-360 B1 C17H12O6 312 269-268 12400 21800 425 B2 C17H14O6 314 289-286 12100 24000 425 G1 C17H12O7 328 246-244 9600 17700 450 G2 C17H14O7 330 240-237 8200 17100 450 M1 C17H12O7 328 299 14150 21250(nm357) 425 M2 C17H14O7 330 293 12100(nm264) 22900(nm357) - P1 C16H15O6 298 320 11200(nm267) 15400(nm262) - Q1 C17H12O7 328 - 11450(nm267) 17500(nm366) - آفلاتوکسیکول C17H14O6 314 234-230 10800(nm261) 14100(nm325) 425 2)
انواع آفلاتوکسین
2-1) آفلاتوکسین B1 آفلاتوکسین B1 با وزن مولکولی 312 و با فرمول C17H12O2 در مقابل نور ماورای بنفش، فلورسانس آبی نسبتاً قوی از خود نشان می‌دهد. این آفلاتوکسین به شکل بلورهای کریستالی بیرنگی است و در حرارت 269-268 درجه سانتیگراد که نقطه ذوب آن است، تجزیه می‌شود. لازم به تذکر است که اخیراً فرم راسمیک آفلاتوکسین B1 نیز سنتز شده است.
2-2) آفلاتوکسین G1 آفلاتوکسین G1 با وزن مولکولی 328 و با فرمول C17H12O7 که در برابر اشعه ماورای بنفش ساطع‌کننده نور فلورسانس سبز است. شواهد اخیر نشان می‌دهد که فلوسانس سبز آفلاتوکسین G1 احتمالاً به دلیل ناخالصی زردرنگی است که می‌توان آن را جدا نمود. در واقع آفلاتوکسین خالص G1 فلورسانس آبی از خود نشان می‌دهد. نقطه ذوب این آفلاتوکسین 246-244 درجه سانتیگراد می‌باشد (42، 16، 32 و 12).
2-3) آفلاتوکسین P1 آفلاتوکسین P1 متابولیتی است که در اثر دمتیلاسیون آفلاتوکسین B1 ایجاد می‌شود. در ادرار حیواناتی چون میمون می‌توان آن را ردیابی کرد. این آفلاتوکسین از کشت آزمایشگاهی قارچ آسپرژیلوس استخراج شده است (42، 32، 16، 15 و 12).
2-4) آفلاتوکسین B2 و G2 آفلاتوکسین B2 با وزن مولکولی 314 و با فرمول C17H14O6 و آفلاتوکسین G2 با وزن مولکولی 330 و با فرمول C17H14O7 می‌باشد. این آفلاتوکسین‌ها به ترتیب در مقابل نور ماورای بنفش، فلورسانس آبی و سبز از خود ساطع می‌کنند. نقطه ذوب آنها نیز به ترتیب 289-286 و 240-247 درجه سانتیگراد است. آفلاتوکسین‌های B1 و G1 را از هیدروژناسیون دقیق آفلاتوکسین‌های B2 و G2 می‌توان به دست آورد (42، 32 و 12).
2-5) آفلاتوکسین‌های M1 و M2 و GM1 اگر آفلاتوکسین B1 به تنهایی یا همراه با آفلاتوکسین‌های دیگر در خورک دام به وسیله حیوانات خورده شود به توکسین‌های دیگری در ترشحات و بافت‌های آنها تبدیل می‌شود، که دو تا از این توکسین‌ها که در شیر حیوانات مشخص گردیده است تحت عنوان توکسین‌های شیر یا اصطلاحاً آفلاتوکسین‌های M1 و M2 نامیده می‌شوند (M از کلمه Milk به معنای شیر منشاء گرفته است).
آفلاتوکسین‌های M1 و M2 از نظر ساختمانی به ترتیب مشتقات 4 هیدروکسی آفلاتوکسین B1 است و خاصیت فلورسانس آفلاتوکسین‌های M1 و M2 3 مرتبه بیشتر از آفلاتوکسین B1 است و خاصیت سرطانزایی، جهش‌زایی و سمیت آن مشابه آفلاتوکسین B1 است، این توکسین بعد از اینکه آفلاتوکسین B1 به وسیله حیوان خورده شود یا مستقیماً به حیوان تزریق گردد در اوره، مدفوع، عضلات، کبد و کلیه قابل تشخیص و شناسایی است. فرمول مولکولی آفلاتوکسین M1 یک کسیژن بیشتر از آفلاتوکسین B1 دارد (فرم هیدروکسی).
آفلاتوکسین M1 شباهت ساختمانی زیادی با آفلاتوکسین B1 و G2 دارد و محصول هیدروکسیله شده آفلاتوکسین G1 به نام آفلاتوکسین GM1 خوانده می‌شود و شباهت زیادی به آفلاتوکسین M1 دارد. ترکیب حاصل از هیدروکسیله شدن آفلاتوکسین را می‌خوانند که از نظر ساختمانی شباهت زیادی به آفلاتوکسین M2 دارد (32). اپتیمم، درجه pH برای تبدیل آفلاتوکسین B1 به M1 در کبد موجودات زنده‌ایی نظیر موش، سنجاب، میمون، گاو، مرغ و انسان در سیستم آنزیمی NADPH حدود 9/8 است. البته کبد بعضی از گونه‌های حیوانی از نظر آفلاتوکسین B1 به M1 ممکن است فعالتر باشند. مثلاً سرعت تبدیل در سنجاب و میمون به ترتیب 1 و 3 درصد است شرایط آزمایش و پارامترهایی نظیر pH و غلظت در سرعت تبدیل دخالت دارند. سمیت حاد آفلاتوکسین M1و تأثیر آن در ممانعت از کدبرداری RNA و سنتز پروتئین‌ها درست به اندازه آفلاتوکسین B1 است ولی تأثیر آن بر DNA کمتر از آفلاتوکسین B1 می‌باشد. قدرت سرطانزایی آفلاتوکسین M1 قدرت سرطانزایی آفلاتوکسین B1 است و قدرت جهش‌زایی آن جهش‌زایی آفلاتوکسین B1 می‌باشد. آفلاتوکسین M1 درجه حرارت پاستوریزاسیون را تحمل می‌کند و بررسی‌های انجام شده با شیرهایی که به طور طبیعی و مصنوعی با آفلاتوکسین M1 آلوده شده بودند مقاومت آفلاتوکسین M1 را ثابت کرده‌اند. آفلاتوکسین M1 درجه حرارت 64 را به مدت 2 ساعت تحمل کرده و حالت اولیه خود را حفظ می‌کند ولی افزایش درجه حرارت ثبات ساختمانی آن را کاهش می‌دهد. فرایندهای مختلف حرارتی که برای تهیه انواع فرآورده‌های لبنی به کار می‌روند، نمی‌توانند پایداری آفلاتوکسین M1 را کاهش می‌دهند و همچنین مشخص شده است که پایداری آفلاتوکسین M1 در طی فرایند حرارتی به نوع آلودگی محصول بستگی ندارد و در شیر با آلودگی طبیعی و مصنوعی مقاومت به حرارت یکسانی داشته است (51، 46، 32 و 26).
امروزه به کمک جذب سطحی خک بنتونیت توانسته‌اند آفلاتوکسین موجود در شیر را حذف نمایند. و البته بنتونیت روی محتوای پروتئین شیر تأثیر گذاشته و ثابت شده است به ازای مصرف هر 2 درصد بنتونیت 5 درصد (یا کمتر) از کل پروتئین شیر کاسته می‌شود. نتایج بررسی‌های مختلف ثابت کرده است که می‌توان از بنتونیت به عنوان وسیله‌ای برای حذف آفلاتوکسین از شیرخام کمک گرفت. البته مطالعات دقیق‌تری برای تعیین ایمنی و حفظ موادمغذی و خواص شیر در صورت کاربرد این روش باید انجام گردد تا مسلم شود که به کیفیت شیر لطمه‌ای وارد نشده و کاملاً سم‌زدایی می‌شود، و نیز از آن می‌توان در ساخت انواع فرآورده‌های لبنی استفاده نمود. آفلاتوکسین M1 در pH بین 5/6-5/4 بسیار پایدار است. آزمایشات مختلف در pHهای متفاوت این نظر را اثبات کرده است، به نظر می‌رسد که محیط اسیدی برای تجزیه آفلاتوکسین M1 قدرت نداشته باشد . غلظطهای بالای آمونیک نیز قادر است آفلاتوکسین M1 راحتی در سطوح خارجی‌تر پنیر که آلودگی به آفلاتوکسین M1 را دارند تخریب کند. برای انجام این کار لازم است که آمونیک در زمان طولانی و در غلظت‌های بالا با محصول اینکوباسیون شود. مشخص شده است که آفلاتوکسین M1 موجود در شیر کامل خام می‌تواند به وسیله آب کسیژنه به همراه ریبوفلاوین و لکتوپرکسیداز غیرفعال گردد. عمل خنثی کردن آفلاتوکسین M1 به کمک این مواد در درجه حرارت 30 درجه سانتیگراد به مدت نیم ساعت صورت می‌گیرد و در طی آن اگر دما را تا 63 درجه سانتیگراد افزایش دهند 98 درصد کاهش آفلاتوکسین M1 خواهیم داشت. این روش در صنایع لبنیات و تخمیر و تولید انواع محصولات لبنی نظیر پنیرسازی به دلیل مشکلات ایمنی و بیولوژیکی و تغییرات ویژگی‌های تغذیه‌ای کاربرد ندارد (51، 32 و 26).
سولفیت پتاسیم سبب خنثی کردن آفلاتوکسین M1 در شیر و فرآورده‌های شیری می‌شود. بیشترین درصد کاهش آفلاتوکسین یعنی 45 درصد به وسیله سولفیت پتاسیم در غلظت 5% مول و در درجه حرارت 25 در زمان 5 ساعت بوده است. با به کارگیری غلظت‌های بیشتر میزان حذف آفلاتوکسین M1 کاهش یافته است (33، 32 و 12).
آفلاتوکسین به صورت کریستال‌های جامد بوده و آفلاتوکسین M1 دارای نقطه ذوب 299 درجه سانتیگراد و آفلاتوکسین M2 دارای نقطه ذوب 293 درجه سانتیگراد می‌باشد. فرمول شیمیایی آفلاتوکسین M1، C17H12O7 بوده و در واقع 4- هیدروکسی آفلاتوکسین B1 است. طیف ماورای بنفش و مادون قرمز این دو توکسین نیز شبیه یکدیگر است. آفلاتوکسین M2 مشابه دی‌هیدروآفلاتوکسین M1 و در واقع 4- هیدروکسی آفلاتوکسین B2 است. به عبارتی از هیدروژنه شدن آفلاتوکسین M1 حاصل شود. فرمول شیمیایی آفلاتوکسین M2، C17H14O7 می‌باشد. گزارش شده است که سمیت آفلاتوکسین M1 در واقع معادل آفلاتوکسینB1 می‌باشد (51، 42، 32 و 12).
2-6) آفلاتوکسین‌های B2a و G2a این دو آفلاتوکسین ترکیب هیدروکسی آفلاتوکسین و مشتق آفلاتوکسین‌های B2 و G2 هستند. آفلاتوکسین B2a ایزومر آفلاتوکسین M2 با گروه هیدروکسیل در موقعیت 2 مولکول است و آفلاتوکسین G2a در واقع 2- هیدروکسی آفلاتوکسین G2 است. در سال 1966 این دو مشتق در شرایط آزمایشگاهی از کشت آسپرژیلوس فلاووس جدا شدند. همچنین با افزودن کاتالیزورهای اسیدی به سوسپانسیون آفلاتوکسین B1 نیز می‌توان آنها را به دست آورد (42، 32 و 12).
2-7) آفلاتوکسین B3 همان آفلاتوکسین B1 است که در حلقه سیکلوپنتان آن اتانول جایگزین شده است و بنابراین در واقع 6- متوکسی، 7- دی‌فوروکومارین است. شکل زیر ساختمان شیمیایی آفلاتوکسین B3 را مشخص کرده است (42، 32 و 12). آفلاتوکسین B3 را، پارازیتیکول هم می‌نامند، و برای جوجه اردک به شدت سمی است ولی برای جنین مرغ سمیت کمتری نسبت به آفلاتوکسین B3 دارد.
2-8) آفلاتوکسین Ro یا آفلاتوکسین L یا آفلاتوکسیکول چنانچه به جای بخش کتونی سیکلوپنتان در آفلاتوکسین B1، گروه هیدروکسیل قرار بگیرد، آفلاتوکسین حاصل را، آفلاتوکسین Ro گویند این توکسین، تغییرات عمده‌ای را در پلاسمای موش صحرایی موجب می‌شود و خاصیت سرطانزایی دارد. این وکنش از تبدیل آفلاتوکسین Ro به آفلاتوکسین B1 (هیدروژناسیون آفلاتوکسین Ro) صورت می‌گیرد. شکل زیر ساختمان شیمیایی آفلاتوکسین Ro یا L را نشان می‌دهد (32 و 12).
2-9) آفلاتوکسین LH1 آفلاتوکسین LH1 مشتق دی‌هیدروکسیله آفلاتوکسین B1 است. شکل زیر ساختمان شیمیایی آفلاتوکسین LH1 را نشان می‌دهد.
2-10) آفلاتوکسین LM1 ترکیبی است که از احیای آفلاتوکسین M1 به دست می‌اید. همچنین به وسیله کسیداسیون آفلاتوکسین Ro یا آفلاتوکسیکول نیز حاصل می‌شود (51، 42، 32 و 12).
2-11) آفلاتوکسین Q1 مشتق مونوهیدروکسیله آفلاتوکسین B1 است که گروه هیدروکسیل روی اتم کربن کربنیل حلقه سیکلوپنتان واقع شده است و بررسی‌های آزمایشگاهی سمیت آن را در موش صحرایی، گاو و موش به اثبات رسانیده است. 2-12) آفلاتوکسین RB1 و RB2 آفلاتوکسین‌های B1 و B2 احیا شده را، AFRB1 و AFRB2 می‌گویند.
2-13) آفلاتوکسین B1-2, 3-oxide آفلاتوکسین B1-2, 3-oxide یا آفلاتوکسین B1-8, 9-oxide یکی از ترکیبات حد واسط و متابولیسم آفلاتوکسین B1 است و در واقع امروزه بر این اعتقاد هستند که این آفلاتوکسین شکل فعال یا ماده سرطانزایی نهایی حاصل از آفلاتوکسین B1 است. قابلیت پیوند کوالانسی ـ اپوکسیدی که این ترکیب با مکرو مولکول‌هایی نظیرRNA, DNA و پروتئین‌ها انجام می‌دهد علت اصلی سمیت و سرطانزایی آفلاتوکسین B1 شناخته شده است.
2-14) آفلاتوکسین o-alky1 این آفلاتوکسین‌ها ناشی از متوکسیله کردن آفلاتوکسین‌ها می‌باشند. ساختمان برخی از مشتقات o-alky1آفلاتوکسین‌ها در شکل‌های زیر مشخص گردیده است. علاوه بر مواد فوق‌الذکر، سایر مشتقات و متابولیت‌های دیگری از آفلاتوکسین‌ها خالص شده‌اند که ساختمان شیمیایی آنها در اشکال زیر مشخص گردیده است.
روش‌های حذف و غیرفعال کردن آفلاتوکسین‌ها
3-1) روش فیزیکی
3-1-1) درجه حرارت حساسیت آفلاتوکسین‌ها، در برابر حرارت تابع شرایط محیطی است. برای مثال وجود رطوبت در موادغذایی باعث افزایش درصد تجزیه و از بین رفتن آفلاتوکسین‌ها در برابر حرارت می‌شود و این کار تحت‌تأثیر هیدرولیز حلقه لکتونی در غلظت‌های مؤثر رطوبت و درجه حرارت انجام می‌گیرد. یا اینکه حضور رطوبت در محیط سبب تحریک وکنش‌های شیمیایی در موقعیت‌های مختلف بعضی مایکوتوکسین‌ها شده و در نتیجه سمیت آنها را تغییر می‌دهد. یا حضور پروتئین‌ها و سایر ترکیبات غذایی در محیط باعث حفظ و ثبات آفلاتوکسین‌ها در موادغذایی حرارت دیده می‌شوند که اینکار ناشی از کاهش نفوذ حرارت و تثبیت توکسین به وسیله اتصال با پروتئین‌ها و سایر اجزای تشکیل‌دهنده نمونه غذایی است (43، 42، 33 و 32). در شرایطی که مایکوتوکسین خالص است مقاومت زیادی در برابر درجه حرارت دارد و برای تجزیه شدن نیاز به درجه حرارت‌های بالاتری دارد. نقطه ذوب 90 درصد از مایکوتوکسین‌ها بالاتر از 100 درجه سانتیگراد است و 70 درصد از توکسین‌های قارچی نقطه ذوب 25-150 دارند. در جدول زیر لیست مایکوتوکسین‌هایی آمده است که در درجه حرارت ذوب‌شان تجزیه می‌شوند. جدول (4-2): مایکوتوکسین‌هایی که در نقطه ذوب‌شان تجزیه می‌کردند.
برای افزایش درصد تجزیه و کاهی انواع مایکوتوکسین‌ها و به خصوص آفلاتوکسین‌ها در موادغذایی انواع روش‌های حرارتی وجود دارد که عبارتند از:
الف) بریان کردن موادغذایی موادغذایی حاوی آفلاتوکسین و یا اوکراتوکسین چنانچه به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت بالاتر از 200-150 سرخ شوند، سمیت آنها به میزان 80-40 درصد کاهش می‌یابد. در مواردی که مایکوتوکسین‌ها داخل بافت میسلیومی قارچ جای گرفته است روش بریان کردن درصد کمی از توکسین‌ها را کاهش می‌دهد (32، 31).
ب) پخت به صورت نان یک کیک یا پخت در فر درجه حرارت‌های 120-90 فر سبب می‌شود که 80 درصد آفلاتوکسین در نان یا کیکی که 20 درصد آفلاتوکسین داشته، تجزیه شود (43، 42، 33 و 32).
ج) پخت در محیط‌های آبکی یا پخت مرطوب درصد تجزیه آفلاتوکسین‌ها و به خصوص آفلاتوکسین B1 در محیط‌های آبکی و در درجه حرارت‌های 120 به مدت 20 دقیقه افزایش می‌یابد. زیرا در این روش حلقه لکتونی آفلاتوکسین بلوکه شده و خصوصیات خود را از دست می‌دهد، برای تأثیر بهتر درجه حرارت مرطوب، را با فشار توأم می‌کنند. تأثیر درجه حرارت توأم با فشار در مقایسه با سایر روش‌های حرارتی در تجزیه و خنثی کردن آفلاتوکسین‌ها در جدول مقایسة روش‌های حرارتی برای تجزیه آفلاتوکسین‌ها مشخص شده است. به نظر می‌رسد که فکتورهای موجود در موادغذایی تأثیر زیادی در اثر حرارت مرطوب دارند. برای مثال موادغذایی که درصد چربی بالایی دارند و یا روغن آنها زیاد است در برابر تجزیه شدن آفلاتوکسین‌ها در روش حرارت مرطوب مقاومت زیادی از خود نشان می‌دهند (33، 32). همچنین در جدول (4-3) درصد تجزیه آفلاتوکسین B1، M1 و اوکراتوکسین در موادغذایی مختلف تحت‌تأثیر شرایط مختلف حرارتی نشان داده شده است. در جدول (4-5) انواع درجات حرارت و روش‌های پیشرفته کاربردی برای ایمن‌سازی و تهیه خورک دام مشخص شده است.
3-1-2) استفاده از صافی‌ها امروزه به کمک صافی‌ها و عمل فیلتراسیون در صنایع مختلف به خصوص صنایع روغن‌کشی قادرند 100 درصد آفلاتوکسین موجود در روغن‌های خورکی را حذف نمایند (32، 31). عمل سانتریفوژ کردن قادر است فقط 65 درصد آفلاتوکسین موجود در روغن بادام‌زمینی را رسوب داده و حذف نماید و 35 درصد باقیمانده را می‌توان به کمک خاک‌های فعال شده و جذب سطحی آفلاتوکسین بر روی آنها از محیط غذایی دور نمود. از اینرو صافی‌های بالشتک مانند به گونه‌ای طراحی می‌شوند که به عنوان ابزاری در صنایع روغن‌کشی بدون ایجاد زیان و یا داشتن هزینه بالا استفاده شوند. فیلترهای مخصوص جذب سموم در مرحله اول عبور روغن 85 درصد آفلاتوکسین را حذف می‌کنند و بعد از عبور مجدد روغن از میان آنها قابلیت حذف آفلاتوکسین به 100 درصد می‌رسد. مقدار جذب آفلاتوکسین تابعی از نوع خک مورد استفاده در صافی است. قدرت جذب خک نیز بستگی به عوام محیطی دارد. برای مثال در pH خنثی 100 میلی‌گرم آفلاتوکسین B1 به وسیله 100 میلی‌گرم کربن فعال جذب می‌شود، و در شرایط pH اسیدی و قلیایی قدرت جذب آن بالاست اما نه به اندازه شرایط pH خنثی. اندازه و مناسبت صافی‌ها برای استفاده در آزمایشگاه، پایلوت، و یا صنعت نیاز به بررسی و کنترل دارد (43، 42، 33 و 32).
3-1-3) جداسازی مکانیکی جداسازی مکانیکی یا سورت محصولات کشاورزی آلوده به آفلاتوکسین، به عنوان یک روش فیزیکی خنثی‌سازی و یا غیرفعال نمودن آفلاتوکسین‌ها نبوده، بلکه سیستمی است جهت پیشگیری از رشد و توسعه و نفوذ عوامل تولیدکننده انواع آفلاتوکسین در محصولات کشاورزی و به خصوص محصولات غذایی.
بنابراین توصیه‌های زیر به عنوان ساده‌ترین راهها برای حفظ کیفیت محصولات و همچنین حذف آفلاتوکسین ارائه می‌گردد (43، 42، 33 و 31):
A محصولات حساس و آسیب‌پذیر در برابر حمله قارچ‌ها و آلودگی به سموم قارچی، باید در محیطی مناسب انبار، نگهداری و حمل و نقل شوند.
A هنگام تهیه و استفاده از غذای دام در مواردی که آلودگی قارچی زیاد است، محصول کنار گذاشته شود، همچنین غذای دام و طیور در شرایط مناسبی از نظر درجه حرارت و رطوبت نگهداری شوند تا از رشد و تکثیر قارچ‌ها و آلودگی به سموم قارچی مصون باقی بمانند.
A دستگاه‌های انتقال و تغذیه دام‌ها نیز باید دارای امکانات نظافت و ضدعفونی باشند.
A داخل مخازن غذا به خصوص بخش‌های قیفی شکل باید کاملاً صیقلی بوده و هم‌زنی جهت به هم زدن محتویات داشته باشد تا امکان چسبیدن مواد به گوشه‌ها و یا جدارهای مخازن وجود نداشته باشد.
A بازرسی مداوم و دقیق کارشناسان فنی و کارگران از مراحل و بخش‌های مختلف تهیه و تولید محصولات، انبار و کنترل کیفیت دقیق مواد اولیه (43، 42، 33 و 32).
3-2) روش اشعه‌دهی
اشعه‌های یونیزه کننده نظیر اشعه گاما اغلب برای حذف میکروارگانیسم‌های بیماریزا از موادغذایی مختلف و انواع خورک دام استفاده می‌شود. این اشعه در مقایسه با اشعه مرئی و یا UV تأثیر بیشتری دارد، چون قابلیت نفوذ آن در انواع جامدات و مایعات بیشتر از سایر اشعه‌ها می‌باشد. اما مولکول‌های آلی با ساختمان پیچیده نظیر انواع آفلاتوکسین‌ها در برابر اشعه گاما آب را تجزیه کرده و سبب آزاد شدن رادیکال‌ها می‌گردد و در نتیجه شرایط لازم برای تخریب و تجزیه آفلاتوکسین‌ها ایجاد می‌شود. برای مثال آفلاتوکسین B1 در محیط خشک به مقدار زیاد در برابر تأثیرات مخرب اشعه گاما مقاومت نشان می‌دهد، حتی اگر از دوزهای بالای اشعه و مقادیر 30 مگاراد استفاده گردد، ولی زمانی که توکسین در محیط مرطوب یا آبکی باشد دوزهای پایین‌تر اشعه گاما (بالاتر از 1 مگاراد) می‌تواند آفلاتوکسین B1 را به طور کامل تجزیه نماید (43 و 33). توانایی تجزیه‌کنندگی اشعه گاما و حساسیت انواع مایکوتوکسین‌ها در مقایسه با انواع منابع اشعه در جدول (4-6) مشخص شده است. جدول (4-6): درصد تجزیه آفلاتوکسین B1 و اوکراتوکسین A در موادغذایی مختلف و در حضور منابع نوری متفاوت با افزایش غلظت آفلاتوکسین یا در حالت خشک و رسوبی، درصد تجزیه به وسیله اشعه گاما کاهش می‌یابد. در جدول (4-7) حساسیت آفلاتوکسین B1 و اوکراتوکسین به اشعه گاما در انواع موادغذایی مشخص گردیده است. در بعضی اوقات کاهش دوز اشعه گاما به میزان 100 کیلوراد باعث تحریک تولید آفلاتوکسین در فرآورده‌های غذایی می‌شود و این مسئله ناشی از تغییرات مسیرهای بیوشیمیایی میکروارگانسیم‌ها و تولید بیشتر مایکوتوکسین می‌باشد. پرتودهی آفلاتوکسین B1 و G1 با نور ماورای بنفش و روی صفحات سلیکاژل با طول موج 365 نانومتر باعث ایجاد دو ترکیب با سمیت کمتر می‌گردد. کاهش سمیت مربوط به باز شدن حلقه لکتونی آفلاتوکسین‌ها نمی‌باشد بلکه مربوط به از دست دادن یکی از بندهای مضاعف در حلقه فوران و یا از دست دادن حلقه فورانی می‌باشد (43، 42 و 33). در جدول (4-8) درصد تجزیه آفلاتوکسین‌ها در انواع موادغذایی که در معرض اشعه UV و مرئی قرار گرفته‌اند، مقایسه شده است.
3-3) روش عمل‌آوری یا فرایند کردن
عمل‌آوری بعضی از محصولات کشاورزی باعث کاهش میزان آفلاتوکسین در محصول نهایی می‌شود. برای مثال آسیاب کردن دانه‌های مرطوب باعث می‌شود عصاره دانه که محتوی مواد پیش‌ساز و تشکیل‌دهنده آفلاتوکسین است، خارج شوند. یا عمل‌آوری و خیساندن دانه‌های ذرت موجب می‌شود که آفلاتوکسین در بخش‌های مختلف دانه قرار گیرد به صورتی که 40 درصد آفلاتوکسین موجود در آب مرحله خیساندن دانه‌ها، 38-30 درصد در فیبر دانه، 17-4 درصد در گلوتن و 10-6 درصد در جوانه قرار می‌گیرد، همچنین اگر دانه برنج مرطوب تخمیر شده و برشته گردد، آفلاتوکسین موجود در دانه از بین می‌رود (33، 32).
3-4) روش شیمیایی
روش‌های شیمیایی غیرفعال کردن انواع آفلاتوکسین در محصولات کشاورزی، باید آفلاتوکسین‌ها را به طور کامل به یک فرآورده غیرسمی تبدیل کند، بدون اینکه تغییری در کیفیت و ماهیت مواد اولیه ایجاد نماید. حلقه لکتونی در ساختمان انواع آفلاتوکسین‌ها بیشترین تأثیر را در برابر عوامل شیمیایی می‌پذیرند. برای مثال در برابر عوامل قلیایی حلقه‌های لکتونی باز شده و هیدرولیز می‌شوند و این کار منجر به کاهش سمیت و سرطانزا بودن آفلاتوکسین‌ها می‌گردد (43، 42، 33 و 32). انواع عوامل شیمیایی برای حذف و غیرفعال کردن آفلاتوکسین‌ها در زیر مشخص شده است .
3-4-1) عوامل کلرینه کننده کلریت سدیم به عنوان اولین و اصلی‌ترین ماده شیمیایی برای حذف انواع آفلاتوکسین‌ها از سطوح آلوده کاربرد دارد و نیز تأثیر خوبی در تجزیه آفلاتوکسین‌ها از موادغذایی دارد. کلرینه کردن موادغذایی با هیپوکلریت سدیم در غلظت‌های 2/0، 1، 5 و 11 درصد همراه با 3 درصد اسیدکلریدریک و یا 10 درصد گاز کلر سبب می‌شود که آفلاتوکسین B1 موجود در موادغذایی و یا به شکل خالص به میزان 100 میلی‌گرم تجزیه شود (33). حداقل غلظت هیپوکلریت سدیم برای تجزیه کامل آفلاتوکسین در موادغذایی، 3-10×8/8 مول در یک دوره دو ساعته است. برای تأثیر بهتر هیپوکلریت سدیم کنترل pH محیط نقش مؤثری دارد و تحت شرایط اسیدی، کلر به صورت یک کسیدکننده قالب عمل می‌کند و آفلاتوکسین B1 موجود در محیط را به ترکیبات دیگری به نام 8 و 9- دی‌کلرو و 8 و 9- دی‌هیدروکسی آفلاتوکسین B1 تبدیل می‌کند. 8 و 9- دی‌کلروآفلاتوکسین B1خاصیت سرطانزایی دارد اما ناپایدار است و به سرعت به 8 و 9- دی‌هیدروکسی آفلاتوکسین B1 هیدرولیز می‌شود. برای سرعت بخشیدن بیشتر به عمل هیدرولیز می‌توان از استن به میزان 5 درصد نیز استفاده نمود. کلرینه کردن موادغذایی برای حذف آفلاتوکسین از آنها مشکلاتی را از نظر ایمنی و سلامت غذاها ایجاد می‌کند، زیرا کلر باقیمانده در ماده غذایی سبب تغییر شکل چربی‌ها و مواد پروتئینی می‌شود. با این وجود سمیت کلر هنوز به درستی مشخص نشده است (43، 42، 33 و 32).
3-4-2) عوامل کسیدکننده × پرکسید هیدروژن: پرکسید هیدروژن ماده‌ای است ارزان قیمت که به آسانی در دسترس است، و کارایی آن در تجزیه سموم قارچی بالا است و باقیمانده آن در موادغذایی تجزیه شده و از بین می‌رود. همچنین پرکسید هیدروژن مانع از رشد قارچ‌های تولیدکننده آفلاتوکسین در محیط کشت‌های مصنوعی می‌شود و در غلظت 5/0 درصد و pH حدود 4 و یا غلظت 6 درصد و 5/9= pHآفلاتوکسین موجود در موادغذایی را به طور کامل تجزیه می‌کند. آزمایشات مشخص کرده است که 97 درصد آفلاتوکسین موجود در بادام‌زمینی بدون چربی وقتی که در معرض غلظت 6 درصد پرکسید هیدروژن قرار گرفته است، تخریب شده است (43، 42، 33 و 32). × اُزن: اُزن یک کسیدکننده قوی است که به صورت عرضی با باندهای دوگانه 9-8 حلقه فوران آفلاتوکسین‌ها اتصال برقرار می‌کند و به صورت الکتروفیلیک جذب حلقه فوران می‌گردد. بنابراین به عنوان یک تجزیه‌کننده قوی برای آفلاتوکسین‌ها محسوب می‌شود و قادر است در مدت چند دقیقه و در درجه حرارت اتاق آفلاتوکسین‌ها را به طور کامل تجزیه کند. به کارگیری اُزن برای کاهش آفلاتوکسین در پنبه دانه‌ای که 22 درصد رطوبت داشته است، باعث شده است که در طی دو ساعت و در درجه حرارت 100 درجه سانتیگراد 91 درصد آفلاتوکسین B1 موجود در پنبه دانه تخریب گردد. البته اُزن سبب کاهش پروتئین و اسیدآمینه و لیزین شده است و بنابراین به عنوان یک روش موفق در حذف آفلاتوکسین از موادغذایی مطرح نمی‌باشد (32). شرایط کاربرد محصول غذایی ماده شیمیایی به طور کامل آفلاتوکسین B1 به مدت 2 ساعت در 100 از بین برده است پنبه دانه با 22 درصد رطوبت اُزن 78 درصد کل آفلاتوکسین موجود در مدت 1 ساعت و دمای 100 از بین رفته است. بادام‌زمینی با 30 درصد رطوبت × بی‌سولفیت سدیم: بی‌سولفیت سدیم به عنوان یک افزودنی در صنایع غذایی کاربرد زیاد دارد و نیز ماده‌ای است که می‌تواند در غیرفعال کردن آفلاتوکسین‌ها در موادغذایی مؤثر باشد. این ماده در غلظت‌های 5/0 و 1 درصد سبب غیرفعال شدن آفلاتوکسین در موادغذایی می‌شود. حتی بسیار مؤثرتر از هیدروکسید سدیم و آمونیک، بی‌سولفیت سدیم به دو صورت در دو جایگاه فعال آفلاتوکسین اثر می‌گذارد، اول اینکه به حلقه لکتونی متصل می‌شود و آن را غیرفعال می‌کند، و دوم اینکه به انتهای حلقه فورانی آفلاتوکسین اضافه می‌شود و آن را غیرفعال می‌کند، و یا همزمان هر دو کار را انجام می‌دهد.
3-4-3) عوامل هیدرولیتیک ü آمونیک: 95 درصد آفلاتوکسین موجود در موادغذایی و خورک دام‌ها با کمک آمونیک گازی یا مایع تخریب می‌گردد. چنانچه در کاربرد این ماده، فکتور مدت زمان استفاده، درجه حرارت و غلظت را در ترکیب مناسبی داشته باشیم، درصد تجزیه و کاهش آفلاتوکسین در موادغذایی به طور مؤثرتری انجام خواهد شد. برای مثال در درجه حرارت 120-80 و فشار بالا لازم است ماده غذایی به مدت 30-15 دقیقه حرارت ببیند تا آفلاتوکسین کاملاً تجزیه شود. آمونیک به وسیله هیدرولیز حلقه لکتونی آفلاتوکسین B1 و دکربوکسیکه کردن آن سمیت آفلاتوکسین B1 را کاهش داده و از بین می‌برد و آن را به ترکیب غیرسمی آفلاتوکسین D1 تبدیل می‌نماید (43، 42، 33 و 32). با رعایت محدودیت‌هایی سازمان غذا و دارو (FDA)، کاربرد آمونیک برای خنثی کردن آفلاتوکسین موجود در غذای دام در ایالات مختلف آمریکا مجاز اعلام شده است (33). تأثیر انواع غلظت‌های آمونیک در تجزیه آفلاتوکسین و در شرایط متفاوت درجه حرارت، فشار و رطوبت در جدول (4-9) مشخص شده است. ü هیدروکسید کلسیم: لایم یا هیدروکسید کلسیم در غلظت 2 درصد موجب تجزیه آفلاتوکسین B1 در موادغذایی می‌شود و اگر آن را به همراه فرمالدئید و یا مونومتیل آمین استفاده کنیم قدرت خنثی‌سازی آن را برای آفلاتوکسین‌ها افزایش می‌دهیم. در زمان به کار بردن هیدروکسید کلسیم حلقه لکتونی آفلاتوکسین B1 باز شده و آفلاتوکسین D1 با سمیت کمتر ایجاد می‌شود (43، 42، 33). ü متیل آمین: 90 درصد آفلاتوکسین موجود در موادغذایی به کمک 25/1 درصد متیل آمین تجزیه می‌شود. همین اثر را فرایند پخت، در دمای 100به مدت 2 ساعت دارد (43، 42 و 33). به طور کلی تأثیر مواد قلیایی در محیط‌های محلول و دمای 110برای تجزیه آفلاتوکسین‌ها به صورت زیر می‌باشد: کربنات آمونیوم > بی‌کربنات سدیم > هیدروکسید آمونیوم > بی‌کربنات پتاسیم > کربنات سدیم > کربنات پتاسیم > هیدروکسید سدیم> هیدروکسید پتاسیم در زیر شرایط کاربرد متیل آمین برای کاهش غلظت آفلاتوکسین موجود در انواع محصولات غذایی مشخص شده است: شرایط کاربرد محصول غذایی ماده شیمیایی در یک رکتور متحرک به مدت 2 ساعت و دمای 100 باعث شده آفلاتوکسین از 111به کمتر از 5 کاهش یابد. بادام‌زمینی با 30 درصد رطوبت متیل آمین 25/1 درصد آفلاتوکسین B1 را از 130 به 14 کاهش داده و آفلاتوکسین B2 را حذف کرده است. پنبه دانه متیل آمین 25/1 و 15درصد آب آفلاتوکسین B1 را از 50/28 به 63 رسانده و کل آفلاتوکسین موجود را از 4000 به 65 رسانیده است و کاهش داده است. بادام‌زمینی با 15 درصد رطوبت متیل آمین 25/1 درصد ü انواع اسیدها: اسیدهای مختلف باعث هیدراسیون آفلاتوکسین B1، در محل پیوند اولفینی 9-8 انتهای حلقه فوران می‌شوند. در این وکنش آفلاتوکسین B2a ایجاد می‌شود که سمیت آن آفلاتوکسین B1است. آفلاتوکسین G1 نیز تحت‌تأثیر اسیدها به آفلاتوکسین G2a تبدیل می‌شود. کاربرد اسیدها در فرایند خنثی‌سازی انواع آفلاتوکسین در موادغذایی موجب کاهش کیفیت و ارزش پروتئینی موادغذایی می‌شود و در تجزیه آفلاتوکسین در فرایندهای تهیه موادغذایی کاربردی ندارند (43، 42، 33 و 32).
3-4-4) سایر مواد شیمیایی محلول‌هایی نظیر دی‌متیل آمین هیدروکلراید (5 درصد)، آلدئیدها (فرمالدئید)، پرکسیدبنزوئیل، ید، سولفات، آهن آمونیکی، پرمنگنات پتاسیم و برات سدیم به مقدار قابل توجهی آفلاتوکسین موجود در موادغذایی را کاهش می‌دهد، اما کاربرد این مواد در موادغذایی محدودیت‌هایی دارد زیرا مشکلاتی را نظیر ایمنی و سلامت ماده غذایی ایجاد می‌کنند (43، 42، 33 و 32).
3-4-5) تصفیه یا استخراج آفلاتوکسین به کمک حلال‌ها روش تصفیه یا حذف آفلاتوکسین از موادغذایی بیشتر برای از بین بردن آفلاتوکسین در روغن‌های حاصل از دانه‌های روغنی کاربرد دارد. از آنجا که آفلاتوکسین به صورت خالص در آب و هیدروکربن‌های اشباع، محلول بوده، اما در حلال‌های قطبی نظیر متانول، اتانول، کلروفورم و بنزن محلول می‌باشد، سیستم‌های به کارگیری حلال‌ها، روش مناسبی برای خنثی‌سازی آفلاتوکسین در موادغذایی آلوده و به خصوص دانه‌های روغنی می‌باشد (43، 42، 33 و 32). از جمله حلال‌هایی که بیش از همه توصیه می‌شوند، استون، بنزن و کلروفورم هستند و متانول به صورت مایع نیز نتایج بسیار خوبی را می‌دهد. همچنین استون به همراه 10 درصد وزنی آب کاهش شدیدی در میزان آفلاتوکسین ایجاد می‌کند (43، 42، 33 و 32). حلال‌ها از طریق تغییر ساختمان شیمیایی آفلاتوکسین، تولید یک فرآورده با سمیت کمتر را می‌نمایند. جدول (4-10) سیستم حلال مناسب برای حذف انواع آفلاتوکسین در انواع محصولات کشاورزی را مشخص کرده است. جدول (4-10): حلال‌های مناسب حذف آفلاتوکسین
3-4-6) ویتامین‌ها
الف) ویتامین A بررسی اثر ترکیبات غذایی بر روی خاصیت سرطانزایی آفلاتوکسین‌ها نتایج منطقی و جالبی را مشخص می‌کند، بدین ترتیب که اگر رژیم غذایی از نظر لیپیدها فقیر باشد برای رشد و گسترش سرطان مناسب است. به علاوه آفلاتوکسین B1 می‌تواند آسیب سرطانی در موش‌های که دچار کمبود ویتامین A هستند ایجاد کند اما در موش‌های کنترل شده، این وضع مشاهده نمی‌شود و از آنجایی که ویتامین A جزو ویتامین‌های محلول در چربی می‌باشد این مطلب به طور کاملتری تایید می‌شود. تست‌های تغذیه‌ای به طور واضح نشان می‌دهد که رژیم غذایی می‌تواند در مطالعات طویل‌المدتی که بر روی بروز غدد سرطانی انجام می‌گیرد مؤثر باشد. برطبق بررسی‌های به عمل آمده هسته دی‌هیدروفوران به تنهایی در مولکول آفلاتوکسین خاصیت سرطانزایی ایجاد می‌کند و احتمال دارد که خاصیت سرطانزایی آفلاتوکسین B1 هم مربوط به دلتالکتون غیراشباع و هم به سیستم حلقوی دی‌فوران در ساختمان شیمیایی توکسین باشد (43، 42، 33 و 22).
ب) ویتامین D بررسی‌های انجام شده نشان می‌دهد که مایکوتوکسین‌ها موجب کاهش مقاومت استخوان‌ها می‌شوند که از طریق شکستن آنها قابل اندازه گیری است. همچنین خاصیت ارتجاعی استخوان‌ها را افزایش می‌دهد که این حالت از طریق خم کردن و هنگام شکستن با یک نیروی عملی به کار گرفته شده قابل اندازه گیری است. این روش محاسبه در مورد بیشتر بیماری‌های ساق پا در پرندگان تجربه شده است. آفلاتوکسین‌ها باعث کاهش میزان فسفر و کلسیم سرم خون می‌شوند و ثابت شده است که این کاهش بستگی به جیره غذایی ندارد (43، 42، 33 و 22). آنچه از این مشاهدات می‌توان انتظار داشت، این مطلب است که اثرات سوء آفلاتوکسین‌ها با کمبود ویتامین D رابطه متقابلی دارد.
پ) ویتامین‌های گروه B تیامین و ویتامین‌های گروه B سنتز آفلاتوکسین را تحریک می‌کنند، ولی ریبوفلاوین و پیریدوکسین در این امر دخالتی نداشته و مؤثر نیستند.
ت) ویتامین E ویتامین E به عنوان یک آنتی‌کسیدان، گرچه تأثیر قابل توجهی بر رشد میسلیوم‌های قارچی از خود نشان نمی‌دهد، لیکن در محیطی که از تترکلریدکربن به عنوان عامل محرک تولید آفلاتوکسین استفاده شده باشد نه تنها اثر مهارکنندگی بر تولید آفلاتوکسین نداشته بلکه برعکس در بالاترین غلظت‌های مورد استفاده از ویتامین E در مقایسه با محیطی که فقط شامل تترکلریدکربن بوده است، افزایش قابل توجهی را در تولید آفلاتوکسین نشان داده است (22، 8).
ث) ویتامین C مطالعات بیوشیمیایی اهمیت ویتامین C را در ایجاد سرطان نشان داده است (22). ویتامین C در غلظت‌های متفاوت اثرات گوناگونی را از خود نشان می‌دهد، به طوری که برخی محققین معتقدند که اثر ویتامین C به عنوان یک آنتی‌کسیدان درست مشابه ویتامین E می‌باشد و در محیط‌های حاوی تترکلریدکربن سبب تشدید آفلاتوکسین می‌شود، این در حالی است که تأثیر چندانی بر رشد میسلیوم‌های قارچی ندارد. اما در بررسی انجام شده توسط برخی از دیگر محققین نتایج متفاوتی حاصل شده است.
3-4-7) ترکیبات فنلی ترکیبات فنلی دارای خواص ضدمیکروبی کاملاً شناخته شده‌ای هستند، امروزه دریافته‌اند که این ترکیبات می‌توانند در مهار تولید آفلاتوکسین در محیط‌های آبکی و برخی از سوبستراهای جامد مؤثر واقع شوند. بدین جهت از ارتووانیلین به منظور جلوگیری از تولید آفلاتوکسین در برخی از غلات و دانه‌های روغنی استفاده شده است. در پژوهشی که در همین خصوص انجام شد، 25 گرم از هر یک از دانه‌های زیر از قبیل: برنج (ar.sita)، گندم (8/3 var.s-)، ذرت (2 var.conga-)، بادام‌زمینی (24-12 var.Ak) و خردل (13var.BR-) در ppm 500 محلول آبکی ارتووانیلین به مدت 2 ساعت در یک ارلن مایر 150 میلی‌لیتری خیسانده شدند (دانه‌های کنترل در آب مقطر خیسانده شدند). پس از جدا کردن مقادیر مازاد محلول، تعداد زیادی از دانه‌های روغنی اتوکلاو شدند. روز بعد، دانه‌ها با 5/0 میلی‌لیتر سوسپانسیون اسپور سویة تولیدکنندة آفلاتوکسین، یعنی آسپرژیلوس پارازیتیکوس (3240NARL-) تلقیح شدند. دانه‌های آلوده شده به مدت 7 روز در حرارت 1 28 اینکوباتور و نگهداری شدند. سپس آفلاتوکسین‌ها استخراج شده و به وسیله اسپکتروفتومتر، میزانشان تعیین گردید. به منظور ارزشیابی اثرات ارتووانیلین، درصد جوانه‌زنی دانه‌های روغنی، تعیین شده است که نتایج آن در جدول زیر درج گردیده است. جدول (4-11): درصد اثر مهارکنندگی ارتووانیلین در تولید آفلاتوکسین و جوانه‌زنی جوانه‌زنی تولید آفلاتوکسین دانه‌ها - 63/85 برنج 22/2 18/54 گندم - 27/52 ذرت 24/8 25/76 بادام‌زمینی 56/10 06/51 خردل تولید آفلاتوکسین توسط آسپرژیلوس پارازیتیکوس بر روی غلات و دانه‌های روغنی می‌توان به مقدار قابل توجهی توسط ارتووانیلین مهار و کنترل نمود. مکزیمم اثر بازدارندگی در تولید آفلاتوکسین به ترتیب در برنج و به میزان 6/85، بادام‌زمینی به میزان 25/76 درصد، گندم به میزان 2/54، ذرت به میزان 3/52 و خردل به میزان 1/51 درصد گزارش شده است. بررسی‌ها نشان می‌دهد که خاصیت مهارکنندگی کافئین سبب مقاومت دانه‌های ککائو و قهوه در مقابل آلودگی با آفلاتوکسین بوده و تصور می‌شود که نقش کافئین در این موارد، مشابه عمل یک بازدارنده طبیعی رشد قارچ است. سنتز آفلاتوکسین‌ها در محیط‌های کشت آسپرژیلوس پارازیتیکوس با افزودن 2 میلی‌گرم کافئین به هر میلی‌لیتر از محیط کشت، کاملاً مهار شده است. ظاهراً به نظر می‌رسد که کافئین توسط محدود کردن جذب کربوهیدرات‌ها که توسط کپک به منظور سنتز این گروه از مایکوتوکسین‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد، سنتز آفلاتوکسین را مهار می‌نماید (33، 27، 23، 15 و 14). دهیدروکسی آنیزول بوتیله (BHA)، هیدروکسی تولوئن بوتیله (BHT)، آلفاتوکوفرول (ویتامین E)، اسیدآسکوربیک (ویتامین C)، گلوتاتیون احیا شده و سیستئین که به عنوان آنتی‌کسیدان کاربرد دارند در محیط کشت آسپرژیلوس پارازیتیکوس حاوی تترکلریدکربن که محرک پرقدرتی در سنتز آفلاتوکسین می‌باشد مورد سنجش قرار گرفته‌اند. نتایج این تحقیقات نشان می‌دهد که حضور BHA در محیط به مقدار زیادی سبب مهار تولید آفلاتوکسین می‌شود و اثر مهارکنندگی این ماده با کاهش غلظت، کاهش می‌یابد. برخلاف این ماده، ویتامین E، ویتامین C، گلوتاتیون احیا شده و سیستئین سبب تشدید اثر تحریکی تترکلریدکربن بر تولید آفلاتوکسین می‌شوند. افزودن ترکیبات فوق تأثیر قابل توجهی بر رشد میسلیوم‌های قارچ نمی‌گذارد. پژوهشگران دریافتند که کسیداسیون چربی‌ها نقش مؤثری در بیوسنتز آفلاتوکسین توسط آسپرژیلوس پارازیتیکوس و آسپرژیلوس فلاووس هم در موجود زنده و هم در آزمایشگاه ایفاء می‌کند. در موجود زنده با مشاهده این مطلب که تولید آفلاتوکسین موقعی که آسپرژیلوس پارازیتیکوس و آسپرژیلوس فلاووس روی دانه‌های روغنی رشد می‌کنند، بیشتر از زمانی است که بر روی دانه‌های حاوی نشاسته رشد می‌نمایند. مشخص شده است که بازده آفلاتوکسین به طور مستقیم در ارتباط با عدد پرکسیدی می‌باشد که در عصاره چربی دانه‌ها وجود دارد. تعدادی از محققین نیز نقش سوربات پتاسیم را در حفظ و نگهداری دانه‌های ذرت که حاوی 30، 24 و 18 درصد رطوبت بوده بررسی نموده‌اند. در این آزمایش از کشت خالص آسپرژیلوس پارازیتیکوس NRRL2999 استفاده گردید و سپس رشد میسلیوم، تولید گازکربنیک و مایکوتوکسین اندازه گیری شد. به طور کلی نتایج حاصله نشان داد که تولید دی‌کسیدکربن و مایکوتوکسین با افزایش مقدار سوربات در محیط کاهش می‌یابد. همچنین سوربات پتاسیم بر روی دانه‌های ذرت که حاوی رطوبت کمتری بوده و در داخل ظرف در بسته در حضور غلظت‌های بالای CO2 نگهداری شده بودند، تأثیر بیشتری نشان داد.
3-5) روش‌های بیولوژیکی و میکروبی
در سال 1966، دانشمندان توانستند از میکروارگانیسم‌هایی مانند مخمرها، کپک‌ها، اسپورکپک‌ها، کتینومیست‌ها، بکتری‌ها، خزه و جلبک‌ها جهت از بین بردن آفلاتوکسین، استفاده نمایند. برای مثال یک نوع بکتری به نام فلاوبکتریوم اورانتیکوم (B-184NRRL) می‌تواند سبب تخریب آفلاتوکسین در محیط کشت شود و عمل سم‌زدایی این میکروارگانیسم در محیط شیر، روغن، ذرت، کره بادام‌زمینی، سبوس و بادام، به اثبات رسیده است. در کلیه این آزمایشات مشخص گردیده است که فلاوبکتریوم اورانتیکوم در حرارت 28، به مدت 12 ساعت، قادر است تمامی آفلاتوکسین‌ها را در محیط کشت از بین ببرد. گونه‌های فراوانی از قارچ‌ها در بخش‌های مختلف گیاه بادام‌زمینی حضور دارند که قانون حکم در میان این میکروارگانیسم‌ها، رقابت است. استفاده از آنتی‌بیوتیک aureofungin نیز، گاهی جهت توقف تولید آفلاتوکسین توصیه شده است. اینچنین مشاهداتی زمینه‌ای برای تحقیقات عمیق در مورد استفاده از روش‌های بیولوژیکی که بتواند مواد آلوده به مایکوتوکسین‌ها را سم‌زدایی کند، به وجود می‌آورد. در یک مقیاس صنعتی (یعنی در مقیاس بزرگ و اقتصادی، نه آزمایشگاهی و کوچک) تمام روش‌های فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی که برای بهبود کیفیت بهداشتی غذاهای آلوده به مایکوتوکسین‌ها به کار برده می‌شوند، باید شرایط زیر را داشته باشند (27، 23 و 14). E انجام تمام روش‌ها آسان و ساده باشد و سبب نشود که به بهای اولیه ماده غذایی زیاد افزوده شود. E روش‌هایی را که به کار می‌بریم، نباید سبب مرطوب شدن یک غذای خشک شوند. زیرا علاوه بر اینکه لازم است مجدداً ماده غذایی را خشک کنیم. اشکالاتی در حمل و نقل و انبارداری ماده غذایی نیز ایجاد می‌شود. E روش مورد استفاده نباید ترکیب اصلی را تغییر دهد، چنین تغییری ارزش غذایی و مخصوصاً میزان پروتئین را تغییر خواهد داد. E روش مورد استفاده نباید سبب ایجاد یا باقی ماندن سمی یا سرطانزا شود.
آفلاتوکسیکوز
آفلاتوکسین‌ها گروهی از توکسین‌های قوی هستند که باعث تأثیرات مخرب در سیستم‌های بیولوژیکی می‌شوند. این متابولیت‌ها در پاره‌ای از پستانداران، پرندگان و ماهی‌ها ایجاد سرطان، جهش و ناهنجاری جنینی می‌کنند.
4-1) آفلاتوکسیکوز در انسان به طور کلی آفلاتوکسین‌ها عامل ایجاد نکروز و سیروز حاد کبدی می‌باشند. علائم آفلاتوکسیکوز در پستانداران، از دست دادن اشتها، کمبود وزن، یرقان و تکثیر سریع سلول‌های مجرای صفراوی است (42، 3 و 2). آلودگی حاد به آفلاتوکسین موجب زردی غشای مخاطی، تجمع چربی در کبد و خونریزی می‌شود. گرچه کبد آماج حمله آفلاتوکسیکوز است، اما ضایعات سرطانی در دیگر اندام‌ها به ویژه معده، کلیه، ریه، غدد بزاقی و اشکی و نسج پوست پستانداران زیاد گزارش شده است (42، 3 و 2). شباهت زیادی در اثرات ناشی از استعمال دوزهای مؤثر آفلاتوکسین B1 روی میمون‌گونه و سندرم‌ری در تایلند وجود دارد. این علائم عبارتند از: تب، اسهال، استفراغ، تشنج و اغما که در کودکان و در میمون‌ها کاملاً به هم شباهت دارند. بررسی موادغذایی مورد مصرف کودکان تایلندی، آلودگی شدید آنها را به آفلاتوکسین نشان می‌دهد (42، 3 و 2). تحقیقات زیادی در زمینه رابطه بین میزان آفلاتوکسین موجود در جیره غذایی و بروز سرطان‌های کبدی انجام شده است. در این زمینه با اندازه گیری میزان آفلاتوکسین موجود در غذاهای مصرفی اعم از خریداری شده از بازار و یا نگهداری شده در انبارهای منازل، رابطه مستقیمی بین مصرف آنها با بروز مصرف آفلاتوکسیکوز مزمن به دست آمده است. از بررسی نتایج حاصله می‌توان قبول کرد که هزاران نفر در نقاط مختلف دنیا از آفلاتوکسیکوز ناشی از تغذیه موادغذایی آلوده رنج می‌برند (42، 29، 25، 20 و 19).
معالجه آفلاتوکسیکوز
واضح است که در هنگام مواجه شدن با یک مورد اثبات شده آفلاتوکسیکوز نخستین اقدامی که باید انجام داد تنظیم یک رژیم غذایی متناسب با موازین بهداشتی است که بدین وسیله منشاء اولیه آلودگی برطرف می‌شود. مخلوطی از کولین، اینوزیتول، ویتامین B2 و ویتامین E باعث جلوگیری از ایجاد ضایعات کبدی ناشی از مصرف آفلاتوکسین می‌گردند. باید یادآوری کرد که می‌توان از اثر سمیت آفلاتوکسین به وسیله معالجه پیشگیرانه با فنوباربیتال جلوگیری نمود. فنوباربیتال آفلاتوکسین را به محصولات غیرسرطانزا متابولیزه می‌کند. به کمک استات کورتیزون و دهیدروکورتیزون یک کاهش نسبی در هپاتوم موش صحرایی به دست آمده، اما چنین معالجه‌ای روی کارسینوم‌های ماهی قزل‌آلا اثری نداشته است. آفلاتوکسین B1 می‌تواند آسیب سرطانی در موش‌هایی که دچار کمبود ویتامین A هستند ایجاد کند، اما در موش‌های کنترل شده این وضعیت بروز نمی‌کند. علاوه بر این آفلاتوکسین باعث کاهش در میزان فسفر و کلسیم سرم خون می‌شود و در نتیجه آفلاتوکسین با کمبود ویتامین D اثرات متقابلی دارد. از آنجایی که این دو ویتامین (D, A) از ویتامین‌های محلول در چربی محسوب می‌شوند، بنابراین رژیم غذایی که از نظر لیپیدها ناقص باشد، برای رشد و گسترش سرطان مناسب است. از اینرو می‌توان انتظار داشت که این دو ویتامین در معالجه آفلاتوکسیکوز نقش مؤثری را ایفا کنند.
خواص بیولوژیکی آفلاتوکسین‌ها
6-1) سرطانزایی آفلاتوکسین عوارض ناشی از مصرف آفلاتوکسین‌ها به دو صورت ظاهر می‌شود: الف) پدیده‌های سریع وابسته به خاصیت سمیت ب) پدیده کند مربوط به خاصیت سرطانزایی ممانعت از بروز بیماری‌های نوع اول لزوماً وقوع اثرات ناشی از مصرف طویل‌المدت توکسین را جلوگیری نمی‌کند. اگر مقدار نسبتاً زیادی از محصولات غذایی بادام‌زمینی که با آسپرژیلوس آلوده شده بودند به رژیم غذایی موش‌ها افزوده شود، احتمال بروز تومورهای کبدی، متناسب با غلظت آفلاتوکسین در غذا وجود دارد. جدول (4-16): رابطه بین غلظت آفلاتوکسین تعیین شده توسط فلورسانس و احتمال بروز سرطان کبد در موش غلظت آفلاتوکسین در غذا (mg/kg) دورة آزمایش (روز) احتمال بروز تومورهای کبدی 0/5 370 15/14 5/3 340 15/11 5/3 335 10/7 0/1 323 51/8 2/0 360 10/2 005/0 384 10/0 چنانچه به جای غذای بادام‌زمینی آلوده به آسپرژیلوس فلاووس، آفلاتوکسین به صورت خالص به غذا افزوده شود، نتایج مشابهی حاصل خواهد شد. هرچه حیوان جوانتر باشد، در مقابل خاصیت سرطانزایی توکسین‌ها حساس خواهد بود. ایجاد تومور در حیوانات تازه از شیر گرفته شده، به میزان 5/0-2/0 میلی گرم آفلاتوکسین در هر کیلوگرم رژیم غذایی آنها کفایت می‌کند و اثراتش غیرقابل برگشت است. گزارش شده است که مصرف روزانه 5 میکروگرم آفلاتوکسین، موجب افزایش غددی که رشد غیرعادی دارند نمی‌شود. حتی پس از یک سال به نظر می‌رسد که حیوانات از نظر سلامت عمومی در وضع بسیار خوبی هستند، لیکن باز هم در 60-50% از موش‌هایی که تحت این اثر غذایی قرار گرفته بودند، نهایتاً غدد سرطانی ظاهر شده بود (19، 18، 10 و 9). برخلاف حالت بالا، خوردن 20 میکروگرم آفلاتوکسین در روز، هرچند که در ابتدا هیچ ضایعه‌ای ایجاد نمی‌کند، اما پس از یک سال بر حالت ضعف مزاجی افزوده شده و در 70-60% موارد هم تومورهای بدخیم به وجود می‌اید. بنابراین افزایش در دوز مصرفی روزانه آفلاتوکسین بدون اینکه موجب ظاهر شدن تعداد خیلی بیشتری تومور بشود، در وضعیت کلی سلامتی، تغییراتی را باعث می‌شود. به علاوه با مشاهده یک مورد سرطان در معده موش انسان به این فکر افتاد که آفلاتوکسین، ممکن است ایجاد سرطان‌های مختلفی در اعضایی به جز کبد بکند، (مثلاً ریه‌ها). مسلم است که رژیم غذایی سهم مهمی را در سرطانی شدن به عهده دارد، بدین ترتیب که اگر رژیم غذایی که از نظر لیپیدها ناقص باشد، برای رشد و گسترش سرطان مساعد است. طبق بررسی‌هایی که به عمل آمده مشخص گردیده است که هسته دی‌هیدرودی فوران تنها ترکیب شیمیایی با خاصیت سرطانزایی در مولکول آفلاتوکسین نیست، و ممکن است که، خاصیت سرطانزایی آفلاتوکسین B1 هم به وجود سیستم دی‌هیدرودی فوران و هم به دلتالکتون غیراشباع، بستگی داشته باشد (19، 18، 10 و 9). همچنین ممکن است که آفلاتوکسین B1 تنها یکی سرطانزای مقدماتی باشد و برای اینکه تبدیل به یک ترکیب سرطانزای فعال بشود، لازم است که احتمالاً توسط آنزیم‌های میکروزومی دگرگون گردد (19، 18، 10 و 9).
6-2) اثرات جهش‌زایی آفلاتوکسین B1 موجب انحرافات کروموزم‌ها، شکسته شدن کروموزم‌ها، شکسته شدن کروماتیدها و شکسته شدن DNA در سلول‌های گیاهی و حیوانی می‌شود. اطلاعات حاصل از تست Ames مشخص کرده است که آفلاتوکسین B1 نسبت به سایر آفلاتوکسین‌ها دارای بیشترین فعالیت جهش‌زایی می‌باشد. جدول (4-17) قدرت جهش‌زایی انواع آفلاتوکسین‌ها را در مقایسه با یکدیگر مشخص کرده است (43-42، 33 و 32). همچنین جهش‌زاد بودن آفلاتوکسین B1 در سالمونلاتیفی موریوم 98 TA در مقایسه با سایر انواع آفلاتوکسین و نیز سرطانزا بودن آنها در حیوانات مختلف بررسی شده است که نتایج آن در جدول (4-18) مشخص شده است (43-42، 33 و 32). ارتباط قابل توجهی بین جهش‌زایی بودن و سمیت انواع آفلاتوکسین‌ها وجود دارد که در جدول (4-19) این ارتباط در مقایسه با آفلاتوکسینB1 به تنهایی مشخص گردیده است (42، 32).
6-3) اثرات بیوشیمیایی مطالعات زیادی در حال انجام است تا مکانیزم و راه‌های مختلف اثرات بیوشیمیایی آفلاتوکسین‌ها در هر سطح را در آزمایشگاه و در موجود زنده مشخص نماید. در موجود زنده عمل متقابل توکسین با اجزای متشکله سلولی، به خصوص نوکلئیک اسید و واسطه‌های متابولیسم پروتئین، حائز اهمیت فراوان است. آفلاتوکسین می‌تواند به عنوان یک بازدارنده بیوسنتز مواد عمل کند، به طوری که دوزهای بالای آن باعث بازدارندگی کلی شده و دوزهای کمتر آن به تدریج بر سیستم‌های مختلف اثر می‌کند. همچنین اثر مستمر آفلاتوکسین بر روی سلول‌های کبدی را می‌توان به صورت زیر طبقه‌بندی نمود، به طوری که هر مرحله نتیجه مرحله قبلی باشد (38، 37).
1. عمل متقابل با DNA و ممانعت از عمل پلیمرازهایی که مسئول سنتز DNA و RNA هستند.
2. جلوگیری از سنتز
DNA. 3. جلوگیری از سنتز RNAو بازداشتن RNA پیامبر (mRNA).
4. تغییر دادن مورفولوژی یا شکل هسته.
5. کاهش در بیوسنتز پروتئین.
6-4) اثر متقابل با DNA آفلاتوکسین می‌تواند به DNA متصل شود و در ساختمان مولکولی آن تغییر ایجاد کند. آفلاتوکسین B1 که از لحاظ بیولوژیکی فعال‌ترین نوع آفلاتوکسین است قویتر از آفلاتوکسین‌های G1 و G2 وارد وکنش می‌شود. براساس عمل متقابل آفلاتوکسین با پورین و مشتقات پورینی که به وسیله دستگاه اسپکتروسکپی تعقیب شده است، یک تفاوت اساسی بین آفلاتوکسین و سایر ترکیباتی که با DNA وکنش نشان می‌دهند، این است که آفلاتوکسین با DNA یک رشته‌ای هم می‌تواند وارد عمل متقابل شود. معهذا اتصال با DNA آنچنان ضعیف است که عبور از یک ستون کروماتوگرافی به سادگی کمپلکس را از هم جدا می‌کند. این عمل متقابل می‌تواند ممانعت از سنتز DNA و RNA را به طور همزمان توسط آفلاتوکسین توضیح دهد.
6-5) جلوگیری از سنتز DNA ممانعت از بیوسنتز اسیدنوکلئیک می‌تواند به علت غیرفعال کردن سیستم‌های سازنده آنزیم باشد، و یا ممکن است به این خاطر باشد که مولکولی‌های DNA ایی که در سلول‌های صدمه دیده وجود دارند دیگر نمی‌توانند مدل خوبی برای همانندسازی باشند. این ضعف همانندسازی DNA تحت‌تأثیر آفلاتوکسین، با عمل کتینومایسین قابل مقایسه است (به خصوص که ساختمان این دو مولکول از بعضی جنبه‌ها مشترک است). کتینومایسین به درون زنجیر مارپیچی دوگانه DNA نفوذ کرده و در جایگاهی که حاوی گوانین است جای می‌گیرد. در حالیکه آدنین و تیمین به صورت تغییر نیافته باقی می‌مانند. مطالعات دقیقی در مورد عملکرد آفلاتوکسین B1 بر روی متابولیسم کبد به عمل آمده است که طی آن از برداشت بافت کبد برای تحریک سنتز استفاده شده است. چنانچه یک برداشت کبدی جزئی در فرد سالم انجام شود، پُرسازی جبرانی حاصل خواهد شد که این فرایندی است که توسط آفلاتوکسین از آن ممانعت می‌شود. اگر 60-30 میکروگرم در روز توکسین در طی پنج روز قبل از عمل جراحی برداشتن از جگر تزریق شود، حیوان تا 24 ساعت پس از جراحی تلف خواهد شد که این نشانه بارزی است از نقش آفلاتوکسین در جلوگیری از سنتز DNA می‌باشد.
6-6) کاهش سنتز RNA آفلاتوکسین‌ها به وسیله عمل متقابل و وکنش با DNA می‌توانند از نسخه‌برداری DNA توسط RNA پلیمراز ممانعت کرده و بدین صورت از بیوسنتز RNA نیز جلوگیری نمایند (13). فعالیت RNA سیتوپلاسمی به کل متوقف می‌شود در حالیکه این حالت در مورد RNA هسته‌ای خفیف‌تر است. فعالیت RNA هسته‌ای در مراحل اولیه کاهش پیدا می‌کند و بعد از 15 دقیقه تماس با آفلاتوکسین، بیوسنتز، به میزان 95-90% متوقف می‌شود. نتایج آزمایشات بر روی موجودات زنده و بر روی سلول‌های کبدی موش نسبت به بررسی‌های آزمایشگاهی بر روی سلول‌های موجود در کشتی از بافت‌های انسانی (به عنوان مثال سلول‌های کلیوی Helas3 و T یا سلول‌های chang کبد) سریعتر به دست می‌اید. این پدیده در دوزهای کم (mg/kg1-5/0) بازگشت‌پذیر است و فرایندهای بیوسنتزی مختلف طبق نظم زیر مجدداً شروع می‌شود: پس از 24 ساعت سنتز کلی RNA هسته‌ای، سپس سنتز RNA هستک، و پس از 48 ساعت سنتز DNA از سر گرفته می‌شود.
6-7) کاهش در بیوسنتز پروتئین قابلیت ممانعت‌کنندگی آفلاتوکسین B1از سنتز پروتئین‌ها از سرعت و میزان اثر ممانعت‌کنندگی آن از سنتز DNA و RNA است (جدول 4-20). بعد از نشاندار کردن اسیدآمینه لوسین مشخص شده که پس از 3 تا 8 ساعت مصرف دوزهای خورکی آفلاتوکسین B1 به میزان mg/kg3، 60 درصد سنتز پروتئین در سلول‌های کبد موش متوقف گردیده است (32). همچنین در بررسی میمون به صورت آزمایشگاهی بعد از 130-5/3 ساعت مصرف mg/kg2 آفلاتوکسین B1، 45 درصد سنتز پروتئین در سلول‌های کبد متوقف شده است و تزریق صفاقی mg/kg60 آفلاتوکسین B1 به جگر موش موجب شده است که 30 درصد از سنتز پروتئین بعد از گذشت 1 ساعت متوقف گردد. اثر ممانعت‌کنندگی آفلاتوکسین B1 و تقلیل بیوسنتز پروتئین‌ها تحت‌تأثیر دو عمل صورت می‌پذیرد (42 و 32): E برهم خوردن نظم پلی‌ریبوزم‌ها. E ایجاد ریبوزم‌های مارپیچی. برهم خوردن نظم پلی‌ریبوزم‌ها بعد از استفاده از آفلاتوکسین B1 در کبد موش، سنجاب، میمون و کشت سلول‌های کشت داده شده و بررسی بافت‌ها مشاهده گردیده که 70 درصد پلی‌زوم‌هایی که درمعرض mg/kg5/1 دوز تزریق صفاقی آفلاتوکسین B1 بوده‌اند بعد از 18 ساعت، تبدیل به مونوزم‌ها شده‌اند. همچنین وقتی کبد موش در معرض mg/kg15 آفلاتوکسین B1 به صورت تزریق صفاقی قرار گرفت بعد از 7 روز، 50 درصد پلی‌زوم‌هایش تبدیل به مونوزم شد. ایجاد ریبوزم‌های مارپیچی حضور پلی‌ریبوزم مارپیچی بعد از تزریق mg/kg1 آفلاتوکسین B1 به جگر و کلیه سنجاب و موش، پس از گذشت 15 دقیقه از تزریق با میکروسکوپ الکترونی تایید شده است. هر مارپیچ ریبوزم دارای 30-25 ریبوزم بوده که با زاویه o 70-60 نسبت به یکدیگر قرار گرفته‌اند و مانع از کارکرد صحیح mRNA می‌شوند. آفلاتوکسین M1 و G1 نیز مانع از سنتز پروتئین‌ها در جگر و کلیه سنجاب می‌شوند. اما اثر آنها در ممانعت‌کنندگی سنتز پروتئین به اندازه آفلاتوکسین B1 نمی‌باشد. سنتز پروتئین‌های پلاسما «آلبومین، فیبرونوژن، آلفا-2 گلبولین، و آلفا اسیدگلیکو پروتیئن» بعد از اضافه کردن مقادیر g100/g 1000-125 آفلاتوکسین B1، ظرف 4-2 ساعت متوقف شده است (42 و 32).
6-8) ممانعت از سنتز چربی‌ها در بررسی آزمایشگاهی و بافتی مشخص شده که آفلاتوکسین B1 مانع از سنتز لیپیدها می‌گردد، و از ورود پارافسفات به داخل فسفولیپیدهای جگر و استات به داخل چربی‌های جگر ممانعت می‌کند. آفلاتوکسین B1 همچنین مانع از ورود استات به داخل تری‌گلسیریدها، اسیدهای چرب، کلسترول و استرکلسترول جگر می‌شود و مصرف mg/kg5-2 آفلاتوکسین به شکل تزریق صفاقی موجب شده که سنتز کلسترول در جگر سنجاب به طور کامل متوقف گردد (42 و 32). جدول (4-20) تأثیر غلظت آفلاتوکسین B1 بر مقدار سنتز RNA, DNA و پروتئین توسط فلاوبکتریوم آرنتیکوم، ارقام داده شده بیانگر میانگینی حاصله از افزایش مقدار آفلاتوکسین B1 و میزان سنتز RNA, DNA و پروتئین در 10 میلی گرم از محیط کشت حاوی بکتری پس از 4 دوره اینکوباسیون در مقایسه با مقدار سنتز RNA, DNA و پروتئین نمونه شاهد که فاقد آفلاتوکسین B1 بوده، می‌باشد. B1 (Mg/1) DNA (Mg) RNA (Mg) پروتئین (Mg) 0 33 70 190 10 27 60 190 25 21 60 180 50 0 60 170 100 - 50 165 6-9) ذخیره آفلاتوکسین در بافت‌ها در کالبد شکافی از بافت‌های اجساد 23 کودک مبتلا به آنسفالوپاتی دژنراسیون چربی در اثرپ مصرف آفلاتوکسین B2 دیده شده که مقدار این توکسین در کبد برابر mg/kg 093/0، در مدفوع 123/0 میلی گرم در کیلوگرم، در معده mg/kg127/0 و در صفرا mg/lit08/0 بوده است. نمونه‌های ادرار 51 کودک مبتلا به بیماری فوق مورد مطالعه قرار گرفته است. در 8 نمونه از ادرار آنها آفلاتوکسین B1 مشاهده شده است. در حالیکه از تجزیه ادرار 23 کودک سالم حضور هیچگونه آفلاتوکسینی گزارش نشده است، که دلیل عدم تماس قبلی این کودکان با آفلاتوکسین می‌باشد. ذخیره شدن آفلاتوکسین در بافت‌های بدن میمون هم شبیه انسان است. آفلاتوکسین در مغز، کبد، کلیه، قلب و صفرای بعضی از حیوانات، حداقل 2 روز و حدکثر 3 روز باقی می‌ماند.
روش‌های تشخیص، تخلیص و شناسایی آفلاتوکسین‌ها
کثر، متدهای استخراج، تشخیص و شناسایی آفلاتوکسین‌ها، براساس قابلیت انحلال آفلاتوکسین‌ها در حلال‌های قطبی مانند کلروفرم، متانول، اتانول، استون، بنزن و غیرقابل نامحلول بودن آنها در حلال‌های غیرقطبی (لیپیدی)، مانند هگزان، اتردوپترول و دی‌اتیل‌اتر، صورت می‌گیرد. استخراج چربی در نمونه‌های مورد آزمایش هنگامی ضروری است که بیش از 20% چربی در ماده مورد وجود داشته باشد. این چربی‌ها می‌تواند، یا به وسیله اتردوپترول و یا پاپنتان، و یا با استفاده از هگزان در دکانتور، در حالیکه خوب تکان داده می‌شود، استخراج گردد. سپس عصاره استخراج شده با آب مقطر، رقیق می‌گردد و به وسیله کلروفوم استخراج می‌شود و فاز محلول در کلروفوم لایه‌ای جداگانه‌ای را تشکیل می‌دهد. پس از جدا شدن حلال، باقیمانده آن را در مخلوطی از پترولیوم اتر، متانول و آب، حل کرده و با تکان‌های شدید آن را جدا می‌کنند. سپس فاز زیرین (متانول) را به وسیله اتردوپترول دوباره شستشو داده و تحت فشار کم تبخیر می‌کنند. روش خالص‌سازی آفلاتوکسین‌ها به وسیله کروماتوگرافی لایه نازک صوت می‌گیرد اگر صفحه را درمعرض اشعه ماورای بنفش قرار دهند ظهور یک نقطه فلورسانس آبی، زیر امواج بلند ماورای بنفش دال بر وجود آفلاتوکسین می‌باشد، در واقع آفلاتوکسین‌ها وقتی در معرض نور ماورای بنفش با طول موج بالا قرار گیرند، دارای خاصیت فلورسانس شدیدتری هستند. این خاصیت موجب می‌شود که این ترکیبات حتی در مقادیر بسیار جزئی (5/0 نانوگرم یا کمتر در نقطه) ngr/spot 5/0 مشخص شوند.
7-1) جداسازی و تشخیص آفلاتوکسین‌ها به روش T.L.C روش کروماتوگرافی لایه نازک یا T.L.C به علت سرعت عمل، حساسیت و سادگی کار، در اکثر آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این روش انتخاب نوع ماده جاذب از اهمیت خاصی برخوردار است و معمولاً سیلیکاژل همراه با گچ در لایه‌های نازک به ضخامت 25/0-5/0 میلی متر مورد استفاده قرار می‌گیرد. حلال‌های رایج مورد استفاده جهت جداسازی آفلاتوکسین‌های مورد آزمایش عبارتند از: (24) کلروفوم/متانول (93:7 تا 99:1) کلروفوم/استون (85:15 تا 90:10) کلروفوم/استون/اتانول (10:1: 89) متانول/آب/اتر (150:25:825) بنزن/اتانول/آب (1:96: 3) معمولاً عمل تبخیر برحسب درجه حرارت و حلال مورد استفاده از 45 دقیقه تا 3 ساعت متغیر است. در این روش با اندازه گیری RF استاندارد، نمونه مورد آزمایش تشخیص داده می‌شود.
7-2) تشخیص و شناسایی آفلاتوکسین به روش گاز کروماتوگرافی ـ اسپکترومتری جرم (G.C.M) شناسایی آفلاتوکسین به کمک روش گاز کروماتوگرافی ـ اسپکترومتری جرم، یک روش سریع برای آفلاتوکسین‌های B1 و B2 می‌باشد که در این روش، تشخیص به کمک بمباران الکترونی و شناسایی یون انتخابی صورت می‌گیرد. در این روش ابتدا عصاره را خالص نموده و سپس به داخل ستون مخصوص تزریق می‌شود. حد تشخیص این روش برای آفلاتوکسین‌های B1 و B2 ppb 1/0 می‌باشد.
7-3) تشخیص و شناسایی آفلاتوکسین با روش کروماتوگرافی مایع با کارکرد بالا (HPLC) در روش HPLC ابتدا به کمک روش‌های شیمیایی، مشتقات آفلاتوکسین‌های مورد بررسی را تهیه می‌نمایند. این عمل بدین منظور صورت می‌گیرد تا قدرت تشخیص، حساسیت و میزان انتخابی و اختصاصی بودن روش افزایش پیدا کند. برای مثال، آفلاتوکسین‌های B1 و G1 به کمک مخلوط اسیدتری فلورواستیک و آب به همی‌استال‌های B2 و G2 که خاصیت فلورسانس بیشتری دارند، تبدیل می‌شود و سپس این مشتقات به وسیله کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس جدا شده و تفکیک می‌گردد. این روش در مقایسه با سایر روش‌ها قابل اطمینان‌ترین و معمول‌ترین روش استفاده برای آنالیز و شناسایی آفلاتوکسین‌ها می‌باشد که به عنوان یک روش استاندارد و برتر در مقابل سایر روش‌های جدید، شناخته شده است
خصوصیات فیزیکی و شیمیایی و مراحل بیوسنتز بعضی از آفلاتوکسین‌ها و متابولیت‌های آنها در جدول (4-1) و شکل (4-1) خلاصه شده است شکل (4-1): مراحل بیوسنتز آفلاتوکسین‌ها (49، 41، 11) جدول (4-1): خصوصیات فیزیکی و شیمیایی آفلاتوکسین‌ها و متابولیت‌های آنها آفلاتوکسین، فرمول مولکولی، وزن مولکولی، نقطه ذوب، جذب UV، نشر فلورسنس nm nm265 nm362-360 B1 C17H12O6 312 269-268 12400 21800 425 B2 C17H14O6 314 289-286 12100 24000 425 G1 C17H12O7 328 246-244 9600 17700 450 G2 C17H14O7 330 240-237 8200 17100 450 M1 C17H12O7 328 299 14150 21250(nm357) 425 M2 C17H14O7 330 293 12100(nm264) 22900(nm357) - P1 C16H15O6 298 320 11200(nm267) 15400(nm262) - Q1 C17H12O7 328 - 11450(nm267) 17500(nm366) - آفلاتوکسیکول C17H14O6 314 234-230 10800(nm261) 14100(nm325) 425 2)
انواع آفلاتوکسین
2-1) آفلاتوکسین B1 آفلاتوکسین B1 با وزن مولکولی 312 و با فرمول C17H12O2 در مقابل نور ماورای بنفش، فلورسانس آبی نسبتاً قوی از خود نشان می‌دهد. این آفلاتوکسین به شکل بلورهای کریستالی بیرنگی است و در حرارت 269-268 درجه سانتیگراد که نقطه ذوب آن است، تجزیه می‌شود. لازم به تذکر است که اخیراً فرم راسمیک آفلاتوکسین B1 نیز سنتز شده است.
2-2) آفلاتوکسین G1 آفلاتوکسین G1 با وزن مولکولی 328 و با فرمول C17H12O7 که در برابر اشعه ماورای بنفش ساطع‌کننده نور فلورسانس سبز است. شواهد اخیر نشان می‌دهد که فلوسانس سبز آفلاتوکسین G1 احتمالاً به دلیل ناخالصی زردرنگی است که می‌توان آن را جدا نمود. در واقع آفلاتوکسین خالص G1 فلورسانس آبی از خود نشان می‌دهد. نقطه ذوب این آفلاتوکسین 246-244 درجه سانتیگراد می‌باشد (42، 16، 32 و 12).
2-3) آفلاتوکسین P1 آفلاتوکسین P1 متابولیتی است که در اثر دمتیلاسیون آفلاتوکسین B1 ایجاد می‌شود. در ادرار حیواناتی چون میمون می‌توان آن را ردیابی کرد. این آفلاتوکسین از کشت آزمایشگاهی قارچ آسپرژیلوس استخراج شده است (42، 32، 16، 15 و 12).
2-4) آفلاتوکسین B2 و G2 آفلاتوکسین B2 با وزن مولکولی 314 و با فرمول C17H14O6 و آفلاتوکسین G2 با وزن مولکولی 330 و با فرمول C17H14O7 می‌باشد. این آفلاتوکسین‌ها به ترتیب در مقابل نور ماورای بنفش، فلورسانس آبی و سبز از خود ساطع می‌کنند. نقطه ذوب آنها نیز به ترتیب 289-286 و 240-247 درجه سانتیگراد است. آفلاتوکسین‌های B1 و G1 را از هیدروژناسیون دقیق آفلاتوکسین‌های B2 و G2 می‌توان به دست آورد (42، 32 و 12).
2-5) آفلاتوکسین‌های M1 و M2 و GM1 اگر آفلاتوکسین B1 به تنهایی یا همراه با آفلاتوکسین‌های دیگر در خورک دام به وسیله حیوانات خورده شود به توکسین‌های دیگری در ترشحات و بافت‌های آنها تبدیل می‌شود، که دو تا از این توکسین‌ها که در شیر حیوانات مشخص گردیده است تحت عنوان توکسین‌های شیر یا اصطلاحاً آفلاتوکسین‌های M1 و M2 نامیده می‌شوند (M از کلمه Milk به معنای شیر منشاء گرفته است).
آفلاتوکسین‌های M1 و M2 از نظر ساختمانی به ترتیب مشتقات 4 هیدروکسی آفلاتوکسین B1 است و خاصیت فلورسانس آفلاتوکسین‌های M1 و M2 3 مرتبه بیشتر از آفلاتوکسین B1 است و خاصیت سرطانزایی، جهش‌زایی و سمیت آن مشابه آفلاتوکسین B1 است، این توکسین بعد از اینکه آفلاتوکسین B1 به وسیله حیوان خورده شود یا مستقیماً به حیوان تزریق گردد در اوره، مدفوع، عضلات، کبد و کلیه قابل تشخیص و شناسایی است. فرمول مولکولی آفلاتوکسین M1 یک کسیژن بیشتر از آفلاتوکسین B1 دارد (فرم هیدروکسی).
آفلاتوکسین M1 شباهت ساختمانی زیادی با آفلاتوکسین B1 و G2 دارد و محصول هیدروکسیله شده آفلاتوکسین G1 به نام آفلاتوکسین GM1 خوانده می‌شود و شباهت زیادی به آفلاتوکسین M1 دارد. ترکیب حاصل از هیدروکسیله شدن آفلاتوکسین را می‌خوانند که از نظر ساختمانی شباهت زیادی به آفلاتوکسین M2 دارد (32). اپتیمم، درجه pH برای تبدیل آفلاتوکسین B1 به M1 در کبد موجودات زنده‌ایی نظیر موش، سنجاب، میمون، گاو، مرغ و انسان در سیستم آنزیمی NADPH حدود 9/8 است. البته کبد بعضی از گونه‌های حیوانی از نظر آفلاتوکسین B1 به M1 ممکن است فعالتر باشند. مثلاً سرعت تبدیل در سنجاب و میمون به ترتیب 1 و 3 درصد است شرایط آزمایش و پارامترهایی نظیر pH و غلظت در سرعت تبدیل دخالت دارند. سمیت حاد آفلاتوکسین M1و تأثیر آن در ممانعت از کدبرداری RNA و سنتز پروتئین‌ها درست به اندازه آفلاتوکسین B1 است ولی تأثیر آن بر DNA کمتر از آفلاتوکسین B1 می‌باشد. قدرت سرطانزایی آفلاتوکسین M1 قدرت سرطانزایی آفلاتوکسین B1 است و قدرت جهش‌زایی آن جهش‌زایی آفلاتوکسین B1 می‌باشد. آفلاتوکسین M1 درجه حرارت پاستوریزاسیون را تحمل می‌کند و بررسی‌های انجام شده با شیرهایی که به طور طبیعی و مصنوعی با آفلاتوکسین M1 آلوده شده بودند مقاومت آفلاتوکسین M1 را ثابت کرده‌اند. آفلاتوکسین M1 درجه حرارت 64 را به مدت 2 ساعت تحمل کرده و حالت اولیه خود را حفظ می‌کند ولی افزایش درجه حرارت ثبات ساختمانی آن را کاهش می‌دهد. فرایندهای مختلف حرارتی که برای تهیه انواع فرآورده‌های لبنی به کار می‌روند، نمی‌توانند پایداری آفلاتوکسین M1 را کاهش می‌دهند و همچنین مشخص شده است که پایداری آفلاتوکسین M1 در طی فرایند حرارتی به نوع آلودگی محصول بستگی ندارد و در شیر با آلودگی طبیعی و مصنوعی مقاومت به حرارت یکسانی داشته است (51، 46، 32 و 26).
امروزه به کمک جذب سطحی خک بنتونیت توانسته‌اند آفلاتوکسین موجود در شیر را حذف نمایند. و البته بنتونیت روی محتوای پروتئین شیر تأثیر گذاشته و ثابت شده است به ازای مصرف هر 2 درصد بنتونیت 5 درصد (یا کمتر) از کل پروتئین شیر کاسته می‌شود. نتایج بررسی‌های مختلف ثابت کرده است که می‌توان از بنتونیت به عنوان وسیله‌ای برای حذف آفلاتوکسین از شیرخام کمک گرفت. البته مطالعات دقیق‌تری برای تعیین ایمنی و حفظ موادمغذی و خواص شیر در صورت کاربرد این روش باید انجام گردد تا مسلم شود که به کیفیت شیر لطمه‌ای وارد نشده و کاملاً سم‌زدایی می‌شود، و نیز از آن می‌توان در ساخت انواع فرآورده‌های لبنی استفاده نمود. آفلاتوکسین M1 در pH بین 5/6-5/4 بسیار پایدار است. آزمایشات مختلف در pHهای متفاوت این نظر را اثبات کرده است، به نظر می‌رسد که محیط اسیدی برای تجزیه آفلاتوکسین M1 قدرت نداشته باشد . غلظطهای بالای آمونیک نیز قادر است آفلاتوکسین M1 راحتی در سطوح خارجی‌تر پنیر که آلودگی به آفلاتوکسین M1 را دارند تخریب کند. برای انجام این کار لازم است که آمونیک در زمان طولانی و در غلظت‌های بالا با محصول اینکوباسیون شود. مشخص شده است که آفلاتوکسین M1 موجود در شیر کامل خام می‌تواند به وسیله آب کسیژنه به همراه ریبوفلاوین و لکتوپرکسیداز غیرفعال گردد. عمل خنثی کردن آفلاتوکسین M1 به کمک این مواد در درجه حرارت 30 درجه سانتیگراد به مدت نیم ساعت صورت می‌گیرد و در طی آن اگر دما را تا 63 درجه سانتیگراد افزایش دهند 98 درصد کاهش آفلاتوکسین M1 خواهیم داشت. این روش در صنایع لبنیات و تخمیر و تولید انواع محصولات لبنی نظیر پنیرسازی به دلیل مشکلات ایمنی و بیولوژیکی و تغییرات ویژگی‌های تغذیه‌ای کاربرد ندارد (51، 32 و 26).
سولفیت پتاسیم سبب خنثی کردن آفلاتوکسین M1 در شیر و فرآورده‌های شیری می‌شود. بیشترین درصد کاهش آفلاتوکسین یعنی 45 درصد به وسیله سولفیت پتاسیم در غلظت 5% مول و در درجه حرارت 25 در زمان 5 ساعت بوده است. با به کارگیری غلظت‌های بیشتر میزان حذف آفلاتوکسین M1 کاهش یافته است (33، 32 و 12).
آفلاتوکسین به صورت کریستال‌های جامد بوده و آفلاتوکسین M1 دارای نقطه ذوب 299 درجه سانتیگراد و آفلاتوکسین M2 دارای نقطه ذوب 293 درجه سانتیگراد می‌باشد. فرمول شیمیایی آفلاتوکسین M1، C17H12O7 بوده و در واقع 4- هیدروکسی آفلاتوکسین B1 است. طیف ماورای بنفش و مادون قرمز این دو توکسین نیز شبیه یکدیگر است. آفلاتوکسین M2 مشابه دی‌هیدروآفلاتوکسین M1 و در واقع 4- هیدروکسی آفلاتوکسین B2 است. به عبارتی از هیدروژنه شدن آفلاتوکسین M1 حاصل شود. فرمول شیمیایی آفلاتوکسین M2، C17H14O7 می‌باشد. گزارش شده است که سمیت آفلاتوکسین M1 در واقع معادل آفلاتوکسینB1 می‌باشد (51، 42، 32 و 12).
2-6) آفلاتوکسین‌های B2a و G2a این دو آفلاتوکسین ترکیب هیدروکسی آفلاتوکسین و مشتق آفلاتوکسین‌های B2 و G2 هستند. آفلاتوکسین B2a ایزومر آفلاتوکسین M2 با گروه هیدروکسیل در موقعیت 2 مولکول است و آفلاتوکسین G2a در واقع 2- هیدروکسی آفلاتوکسین G2 است. در سال 1966 این دو مشتق در شرایط آزمایشگاهی از کشت آسپرژیلوس فلاووس جدا شدند. همچنین با افزودن کاتالیزورهای اسیدی به سوسپانسیون آفلاتوکسین B1 نیز می‌توان آنها را به دست آورد (42، 32 و 12).
2-7) آفلاتوکسین B3 همان آفلاتوکسین B1 است که در حلقه سیکلوپنتان آن اتانول جایگزین شده است و بنابراین در واقع 6- متوکسی، 7- دی‌فوروکومارین است. شکل زیر ساختمان شیمیایی آفلاتوکسین B3 را مشخص کرده است (42، 32 و 12). آفلاتوکسین B3 را، پارازیتیکول هم می‌نامند، و برای جوجه اردک به شدت سمی است ولی برای جنین مرغ سمیت کمتری نسبت به آفلاتوکسین B3 دارد.
2-8) آفلاتوکسین Ro یا آفلاتوکسین L یا آفلاتوکسیکول چنانچه به جای بخش کتونی سیکلوپنتان در آفلاتوکسین B1، گروه هیدروکسیل قرار بگیرد، آفلاتوکسین حاصل را، آفلاتوکسین Ro گویند این توکسین، تغییرات عمده‌ای را در پلاسمای موش صحرایی موجب می‌شود و خاصیت سرطانزایی دارد. این وکنش از تبدیل آفلاتوکسین Ro به آفلاتوکسین B1 (هیدروژناسیون آفلاتوکسین Ro) صورت می‌گیرد. شکل زیر ساختمان شیمیایی آفلاتوکسین Ro یا L را نشان می‌دهد (32 و 12).
2-9) آفلاتوکسین LH1 آفلاتوکسین LH1 مشتق دی‌هیدروکسیله آفلاتوکسین B1 است. شکل زیر ساختمان شیمیایی آفلاتوکسین LH1 را نشان می‌دهد.
2-10) آفلاتوکسین LM1 ترکیبی است که از احیای آفلاتوکسین M1 به دست می‌اید. همچنین به وسیله کسیداسیون آفلاتوکسین Ro یا آفلاتوکسیکول نیز حاصل می‌شود (51، 42، 32 و 12).
2-11) آفلاتوکسین Q1 مشتق مونوهیدروکسیله آفلاتوکسین B1 است که گروه هیدروکسیل روی اتم کربن کربنیل حلقه سیکلوپنتان واقع شده است و بررسی‌های آزمایشگاهی سمیت آن را در موش صحرایی، گاو و موش به اثبات رسانیده است. 2-12) آفلاتوکسین RB1 و RB2 آفلاتوکسین‌های B1 و B2 احیا شده را، AFRB1 و AFRB2 می‌گویند.
2-13) آفلاتوکسین B1-2, 3-oxide آفلاتوکسین B1-2, 3-oxide یا آفلاتوکسین B1-8, 9-oxide یکی از ترکیبات حد واسط و متابولیسم آفلاتوکسین B1 است و در واقع امروزه بر این اعتقاد هستند که این آفلاتوکسین شکل فعال یا ماده سرطانزایی نهایی حاصل از آفلاتوکسین B1 است. قابلیت پیوند کوالانسی ـ اپوکسیدی که این ترکیب با مکرو مولکول‌هایی نظیرRNA, DNA و پروتئین‌ها انجام می‌دهد علت اصلی سمیت و سرطانزایی آفلاتوکسین B1 شناخته شده است.
2-14) آفلاتوکسین o-alky1 این آفلاتوکسین‌ها ناشی از متوکسیله کردن آفلاتوکسین‌ها می‌باشند. ساختمان برخی از مشتقات o-alky1آفلاتوکسین‌ها در شکل‌های زیر مشخص گردیده است. علاوه بر مواد فوق‌الذکر، سایر مشتقات و متابولیت‌های دیگری از آفلاتوکسین‌ها خالص شده‌اند که ساختمان شیمیایی آنها در اشکال زیر مشخص گردیده است.
روش‌های حذف و غیرفعال کردن آفلاتوکسین‌ها
3-1) روش فیزیکی
3-1-1) درجه حرارت حساسیت آفلاتوکسین‌ها، در برابر حرارت تابع شرایط محیطی است. برای مثال وجود رطوبت در موادغذایی باعث افزایش درصد تجزیه و از بین رفتن آفلاتوکسین‌ها در برابر حرارت می‌شود و این کار تحت‌تأثیر هیدرولیز حلقه لکتونی در غلظت‌های مؤثر رطوبت و درجه حرارت انجام می‌گیرد. یا اینکه حضور رطوبت در محیط سبب تحریک وکنش‌های شیمیایی در موقعیت‌های مختلف بعضی مایکوتوکسین‌ها شده و در نتیجه سمیت آنها را تغییر می‌دهد. یا حضور پروتئین‌ها و سایر ترکیبات غذایی در محیط باعث حفظ و ثبات آفلاتوکسین‌ها در موادغذایی حرارت دیده می‌شوند که اینکار ناشی از کاهش نفوذ حرارت و تثبیت توکسین به وسیله اتصال با پروتئین‌ها و سایر اجزای تشکیل‌دهنده نمونه غذایی است (43، 42، 33 و 32). در شرایطی که مایکوتوکسین خالص است مقاومت زیادی در برابر درجه حرارت دارد و برای تجزیه شدن نیاز به درجه حرارت‌های بالاتری دارد. نقطه ذوب 90 درصد از مایکوتوکسین‌ها بالاتر از 100 درجه سانتیگراد است و 70 درصد از توکسین‌های قارچی نقطه ذوب 25-150 دارند. در جدول زیر لیست مایکوتوکسین‌هایی آمده است که در درجه حرارت ذوب‌شان تجزیه می‌شوند. جدول (4-2): مایکوتوکسین‌هایی که در نقطه ذوب‌شان تجزیه می‌کردند.
برای افزایش درصد تجزیه و کاهی انواع مایکوتوکسین‌ها و به خصوص آفلاتوکسین‌ها در موادغذایی انواع روش‌های حرارتی وجود دارد که عبارتند از:
الف) بریان کردن موادغذایی موادغذایی حاوی آفلاتوکسین و یا اوکراتوکسین چنانچه به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت بالاتر از 200-150 سرخ شوند، سمیت آنها به میزان 80-40 درصد کاهش می‌یابد. در مواردی که مایکوتوکسین‌ها داخل بافت میسلیومی قارچ جای گرفته است روش بریان کردن درصد کمی از توکسین‌ها را کاهش می‌دهد (32، 31).
ب) پخت به صورت نان یک کیک یا پخت در فر درجه حرارت‌های 120-90 فر سبب می‌شود که 80 درصد آفلاتوکسین در نان یا کیکی که 20 درصد آفلاتوکسین داشته، تجزیه شود (43، 42، 33 و 32).
ج) پخت در محیط‌های آبکی یا پخت مرطوب درصد تجزیه آفلاتوکسین‌ها و به خصوص آفلاتوکسین B1 در محیط‌های آبکی و در درجه حرارت‌های 120 به مدت 20 دقیقه افزایش می‌یابد. زیرا در این روش حلقه لکتونی آفلاتوکسین بلوکه شده و خصوصیات خود را از دست می‌دهد، برای تأثیر بهتر درجه حرارت مرطوب، را با فشار توأم می‌کنند. تأثیر درجه حرارت توأم با فشار در مقایسه با سایر روش‌های حرارتی در تجزیه و خنثی کردن آفلاتوکسین‌ها در جدول مقایسة روش‌های حرارتی برای تجزیه آفلاتوکسین‌ها مشخص شده است. به نظر می‌رسد که فکتورهای موجود در موادغذایی تأثیر زیادی در اثر حرارت مرطوب دارند. برای مثال موادغذایی که درصد چربی بالایی دارند و یا روغن آنها زیاد است در برابر تجزیه شدن آفلاتوکسین‌ها در روش حرارت مرطوب مقاومت زیادی از خود نشان می‌دهند (33، 32). همچنین در جدول (4-3) درصد تجزیه آفلاتوکسین B1، M1 و اوکراتوکسین در موادغذایی مختلف تحت‌تأثیر شرایط مختلف حرارتی نشان داده شده است. در جدول (4-5) انواع درجات حرارت و روش‌های پیشرفته کاربردی برای ایمن‌سازی و تهیه خورک دام مشخص شده است.
3-1-2) استفاده از صافی‌ها امروزه به کمک صافی‌ها و عمل فیلتراسیون در صنایع مختلف به خصوص صنایع روغن‌کشی قادرند 100 درصد آفلاتوکسین موجود در روغن‌های خورکی را حذف نمایند (32، 31). عمل سانتریفوژ کردن قادر است فقط 65 درصد آفلاتوکسین موجود در روغن بادام‌زمینی را رسوب داده و حذف نماید و 35 درصد باقیمانده را می‌توان به کمک خاک‌های فعال شده و جذب سطحی آفلاتوکسین بر روی آنها از محیط غذایی دور نمود. از اینرو صافی‌های بالشتک مانند به گونه‌ای طراحی می‌شوند که به عنوان ابزاری در صنایع روغن‌کشی بدون ایجاد زیان و یا داشتن هزینه بالا استفاده شوند. فیلترهای مخصوص جذب سموم در مرحله اول عبور روغن 85 درصد آفلاتوکسین را حذف می‌کنند و بعد از عبور مجدد روغن از میان آنها قابلیت حذف آفلاتوکسین به 100 درصد می‌رسد. مقدار جذب آفلاتوکسین تابعی از نوع خک مورد استفاده در صافی است. قدرت جذب خک نیز بستگی به عوام محیطی دارد. برای مثال در pH خنثی 100 میلی‌گرم آفلاتوکسین B1 به وسیله 100 میلی‌گرم کربن فعال جذب می‌شود، و در شرایط pH اسیدی و قلیایی قدرت جذب آن بالاست اما نه به اندازه شرایط pH خنثی. اندازه و مناسبت صافی‌ها برای استفاده در آزمایشگاه، پایلوت، و یا صنعت نیاز به بررسی و کنترل دارد (43، 42، 33 و 32).
3-1-3) جداسازی مکانیکی جداسازی مکانیکی یا سورت محصولات کشاورزی آلوده به آفلاتوکسین، به عنوان یک روش فیزیکی خنثی‌سازی و یا غیرفعال نمودن آفلاتوکسین‌ها نبوده، بلکه سیستمی است جهت پیشگیری از رشد و توسعه و نفوذ عوامل تولیدکننده انواع آفلاتوکسین در محصولات کشاورزی و به خصوص محصولات غذایی.
بنابراین توصیه‌های زیر به عنوان ساده‌ترین راهها برای حفظ کیفیت محصولات و همچنین حذف آفلاتوکسین ارائه می‌گردد (43، 42، 33 و 31):
A محصولات حساس و آسیب‌پذیر در برابر حمله قارچ‌ها و آلودگی به سموم قارچی، باید در محیطی مناسب انبار، نگهداری و حمل و نقل شوند.
A هنگام تهیه و استفاده از غذای دام در مواردی که آلودگی قارچی زیاد است، محصول کنار گذاشته شود، همچنین غذای دام و طیور در شرایط مناسبی از نظر درجه حرارت و رطوبت نگهداری شوند تا از رشد و تکثیر قارچ‌ها و آلودگی به سموم قارچی مصون باقی بمانند.
A دستگاه‌های انتقال و تغذیه دام‌ها نیز باید دارای امکانات نظافت و ضدعفونی باشند.
A داخل مخازن غذا به خصوص بخش‌های قیفی شکل باید کاملاً صیقلی بوده و هم‌زنی جهت به هم زدن محتویات داشته باشد تا امکان چسبیدن مواد به گوشه‌ها و یا جدارهای مخازن وجود نداشته باشد.
A بازرسی مداوم و دقیق کارشناسان فنی و کارگران از مراحل و بخش‌های مختلف تهیه و تولید محصولات، انبار و کنترل کیفیت دقیق مواد اولیه (43، 42، 33 و 32).
3-2) روش اشعه‌دهی
اشعه‌های یونیزه کننده نظیر اشعه گاما اغلب برای حذف میکروارگانیسم‌های بیماریزا از موادغذایی مختلف و انواع خورک دام استفاده می‌شود. این اشعه در مقایسه با اشعه مرئی و یا UV تأثیر بیشتری دارد، چون قابلیت نفوذ آن در انواع جامدات و مایعات بیشتر از سایر اشعه‌ها می‌باشد. اما مولکول‌های آلی با ساختمان پیچیده نظیر انواع آفلاتوکسین‌ها در برابر اشعه گاما آب را تجزیه کرده و سبب آزاد شدن رادیکال‌ها می‌گردد و در نتیجه شرایط لازم برای تخریب و تجزیه آفلاتوکسین‌ها ایجاد می‌شود. برای مثال آفلاتوکسین B1 در محیط خشک به مقدار زیاد در برابر تأثیرات مخرب اشعه گاما مقاومت نشان می‌دهد، حتی اگر از دوزهای بالای اشعه و مقادیر 30 مگاراد استفاده گردد، ولی زمانی که توکسین در محیط مرطوب یا آبکی باشد دوزهای پایین‌تر اشعه گاما (بالاتر از 1 مگاراد) می‌تواند آفلاتوکسین B1 را به طور کامل تجزیه نماید (43 و 33). توانایی تجزیه‌کنندگی اشعه گاما و حساسیت انواع مایکوتوکسین‌ها در مقایسه با انواع منابع اشعه در جدول (4-6) مشخص شده است. جدول (4-6): درصد تجزیه آفلاتوکسین B1 و اوکراتوکسین A در موادغذایی مختلف و در حضور منابع نوری متفاوت با افزایش غلظت آفلاتوکسین یا در حالت خشک و رسوبی، درصد تجزیه به وسیله اشعه گاما کاهش می‌یابد. در جدول (4-7) حساسیت آفلاتوکسین B1 و اوکراتوکسین به اشعه گاما در انواع موادغذایی مشخص گردیده است. در بعضی اوقات کاهش دوز اشعه گاما به میزان 100 کیلوراد باعث تحریک تولید آفلاتوکسین در فرآورده‌های غذایی می‌شود و این مسئله ناشی از تغییرات مسیرهای بیوشیمیایی میکروارگانسیم‌ها و تولید بیشتر مایکوتوکسین می‌باشد. پرتودهی آفلاتوکسین B1 و G1 با نور ماورای بنفش و روی صفحات سلیکاژل با طول موج 365 نانومتر باعث ایجاد دو ترکیب با سمیت کمتر می‌گردد. کاهش سمیت مربوط به باز شدن حلقه لکتونی آفلاتوکسین‌ها نمی‌باشد بلکه مربوط به از دست دادن یکی از بندهای مضاعف در حلقه فوران و یا از دست دادن حلقه فورانی می‌باشد (43، 42 و 33). در جدول (4-8) درصد تجزیه آفلاتوکسین‌ها در انواع موادغذایی که در معرض اشعه UV و مرئی قرار گرفته‌اند، مقایسه شده است.
3-3) روش عمل‌آوری یا فرایند کردن
عمل‌آوری بعضی از محصولات کشاورزی باعث کاهش میزان آفلاتوکسین در محصول نهایی می‌شود. برای مثال آسیاب کردن دانه‌های مرطوب باعث می‌شود عصاره دانه که محتوی مواد پیش‌ساز و تشکیل‌دهنده آفلاتوکسین است، خارج شوند. یا عمل‌آوری و خیساندن دانه‌های ذرت موجب می‌شود که آفلاتوکسین در بخش‌های مختلف دانه قرار گیرد به صورتی که 40 درصد آفلاتوکسین موجود در آب مرحله خیساندن دانه‌ها، 38-30 درصد در فیبر دانه، 17-4 درصد در گلوتن و 10-6 درصد در جوانه قرار می‌گیرد، همچنین اگر دانه برنج مرطوب تخمیر شده و برشته گردد، آفلاتوکسین موجود در دانه از بین می‌رود (33، 32).
3-4) روش شیمیایی
روش‌های شیمیایی غیرفعال کردن انواع آفلاتوکسین در محصولات کشاورزی، باید آفلاتوکسین‌ها را به طور کامل به یک فرآورده غیرسمی تبدیل کند، بدون اینکه تغییری در کیفیت و ماهیت مواد اولیه ایجاد نماید. حلقه لکتونی در ساختمان انواع آفلاتوکسین‌ها بیشترین تأثیر را در برابر عوامل شیمیایی می‌پذیرند. برای مثال در برابر عوامل قلیایی حلقه‌های لکتونی باز شده و هیدرولیز می‌شوند و این کار منجر به کاهش سمیت و سرطانزا بودن آفلاتوکسین‌ها می‌گردد (43، 42، 33 و 32). انواع عوامل شیمیایی برای حذف و غیرفعال کردن آفلاتوکسین‌ها در زیر مشخص شده است .
3-4-1) عوامل کلرینه کننده کلریت سدیم به عنوان اولین و اصلی‌ترین ماده شیمیایی برای حذف انواع آفلاتوکسین‌ها از سطوح آلوده کاربرد دارد و نیز تأثیر خوبی در تجزیه آفلاتوکسین‌ها از موادغذایی دارد. کلرینه کردن موادغذایی با هیپوکلریت سدیم در غلظت‌های 2/0، 1، 5 و 11 درصد همراه با 3 درصد اسیدکلریدریک و یا 10 درصد گاز کلر سبب می‌شود که آفلاتوکسین B1 موجود در موادغذایی و یا به شکل خالص به میزان 100 میلی‌گرم تجزیه شود (33). حداقل غلظت هیپوکلریت سدیم برای تجزیه کامل آفلاتوکسین در موادغذایی، 3-10×8/8 مول در یک دوره دو ساعته است. برای تأثیر بهتر هیپوکلریت سدیم کنترل pH محیط نقش مؤثری دارد و تحت شرایط اسیدی، کلر به صورت یک کسیدکننده قالب عمل می‌کند و آفلاتوکسین B1 موجود در محیط را به ترکیبات دیگری به نام 8 و 9- دی‌کلرو و 8 و 9- دی‌هیدروکسی آفلاتوکسین B1 تبدیل می‌کند. 8 و 9- دی‌کلروآفلاتوکسین B1خاصیت سرطانزایی دارد اما ناپایدار است و به سرعت به 8 و 9- دی‌هیدروکسی آفلاتوکسین B1 هیدرولیز می‌شود. برای سرعت بخشیدن بیشتر به عمل هیدرولیز می‌توان از استن به میزان 5 درصد نیز استفاده نمود. کلرینه کردن موادغذایی برای حذف آفلاتوکسین از آنها مشکلاتی را از نظر ایمنی و سلامت غذاها ایجاد می‌کند، زیرا کلر باقیمانده در ماده غذایی سبب تغییر شکل چربی‌ها و مواد پروتئینی می‌شود. با این وجود سمیت کلر هنوز به درستی مشخص نشده است (43، 42، 33 و 32).
3-4-2) عوامل کسیدکننده × پرکسید هیدروژن: پرکسید هیدروژن ماده‌ای است ارزان قیمت که به آسانی در دسترس است، و کارایی آن در تجزیه سموم قارچی بالا است و باقیمانده آن در موادغذایی تجزیه شده و از بین می‌رود. همچنین پرکسید هیدروژن مانع از رشد قارچ‌های تولیدکننده آفلاتوکسین در محیط کشت‌های مصنوعی می‌شود و در غلظت 5/0 درصد و pH حدود 4 و یا غلظت 6 درصد و 5/9= pHآفلاتوکسین موجود در موادغذایی را به طور کامل تجزیه می‌کند. آزمایشات مشخص کرده است که 97 درصد آفلاتوکسین موجود در بادام‌زمینی بدون چربی وقتی که در معرض غلظت 6 درصد پرکسید هیدروژن قرار گرفته است، تخریب شده است (43، 42، 33 و 32). × اُزن: اُزن یک کسیدکننده قوی است که به صورت عرضی با باندهای دوگانه 9-8 حلقه فوران آفلاتوکسین‌ها اتصال برقرار می‌کند و به صورت الکتروفیلیک جذب حلقه فوران می‌گردد. بنابراین به عنوان یک تجزیه‌کننده قوی برای آفلاتوکسین‌ها محسوب می‌شود و قادر است در مدت چند دقیقه و در درجه حرارت اتاق آفلاتوکسین‌ها را به طور کامل تجزیه کند. به کارگیری اُزن برای کاهش آفلاتوکسین در پنبه دانه‌ای که 22 درصد رطوبت داشته است، باعث شده است که در طی دو ساعت و در درجه حرارت 100 درجه سانتیگراد 91 درصد آفلاتوکسین B1 موجود در پنبه دانه تخریب گردد. البته اُزن سبب کاهش پروتئین و اسیدآمینه و لیزین شده است و بنابراین به عنوان یک روش موفق در حذف آفلاتوکسین از موادغذایی مطرح نمی‌باشد (32). شرایط کاربرد محصول غذایی ماده شیمیایی به طور کامل آفلاتوکسین B1 به مدت 2 ساعت در 100 از بین برده است پنبه دانه با 22 درصد رطوبت اُزن 78 درصد کل آفلاتوکسین موجود در مدت 1 ساعت و دمای 100 از بین رفته است. بادام‌زمینی با 30 درصد رطوبت × بی‌سولفیت سدیم: بی‌سولفیت سدیم به عنوان یک افزودنی در صنایع غذایی کاربرد زیاد دارد و نیز ماده‌ای است که می‌تواند در غیرفعال کردن آفلاتوکسین‌ها در موادغذایی مؤثر باشد. این ماده در غلظت‌های 5/0 و 1 درصد سبب غیرفعال شدن آفلاتوکسین در موادغذایی می‌شود. حتی بسیار مؤثرتر از هیدروکسید سدیم و آمونیک، بی‌سولفیت سدیم به دو صورت در دو جایگاه فعال آفلاتوکسین اثر می‌گذارد، اول اینکه به حلقه لکتونی متصل می‌شود و آن را غیرفعال می‌کند، و دوم اینکه به انتهای حلقه فورانی آفلاتوکسین اضافه می‌شود و آن را غیرفعال می‌کند، و یا همزمان هر دو کار را انجام می‌دهد.
3-4-3) عوامل هیدرولیتیک ü آمونیک: 95 درصد آفلاتوکسین موجود در موادغذایی و خورک دام‌ها با کمک آمونیک گازی یا مایع تخریب می‌گردد. چنانچه در کاربرد این ماده، فکتور مدت زمان استفاده، درجه حرارت و غلظت را در ترکیب مناسبی داشته باشیم، درصد تجزیه و کاهش آفلاتوکسین در موادغذایی به طور مؤثرتری انجام خواهد شد. برای مثال در درجه حرارت 120-80 و فشار بالا لازم است ماده غذایی به مدت 30-15 دقیقه حرارت ببیند تا آفلاتوکسین کاملاً تجزیه شود. آمونیک به وسیله هیدرولیز حلقه لکتونی آفلاتوکسین B1 و دکربوکسیکه کردن آن سمیت آفلاتوکسین B1 را کاهش داده و از بین می‌برد و آن را به ترکیب غیرسمی آفلاتوکسین D1 تبدیل می‌نماید (43، 42، 33 و 32). با رعایت محدودیت‌هایی سازمان غذا و دارو (FDA)، کاربرد آمونیک برای خنثی کردن آفلاتوکسین موجود در غذای دام در ایالات مختلف آمریکا مجاز اعلام شده است (33). تأثیر انواع غلظت‌های آمونیک در تجزیه آفلاتوکسین و در شرایط متفاوت درجه حرارت، فشار و رطوبت در جدول (4-9) مشخص شده است. ü هیدروکسید کلسیم: لایم یا هیدروکسید کلسیم در غلظت 2 درصد موجب تجزیه آفلاتوکسین B1 در موادغذایی می‌شود و اگر آن را به همراه فرمالدئید و یا مونومتیل آمین استفاده کنیم قدرت خنثی‌سازی آن را برای آفلاتوکسین‌ها افزایش می‌دهیم. در زمان به کار بردن هیدروکسید کلسیم حلقه لکتونی آفلاتوکسین B1 باز شده و آفلاتوکسین D1 با سمیت کمتر ایجاد می‌شود (43، 42، 33). ü متیل آمین: 90 درصد آفلاتوکسین موجود در موادغذایی به کمک 25/1 درصد متیل آمین تجزیه می‌شود. همین اثر را فرایند پخت، در دمای 100به مدت 2 ساعت دارد (43، 42 و 33). به طور کلی تأثیر مواد قلیایی در محیط‌های محلول و دمای 110برای تجزیه آفلاتوکسین‌ها به صورت زیر می‌باشد: کربنات آمونیوم > بی‌کربنات سدیم > هیدروکسید آمونیوم > بی‌کربنات پتاسیم > کربنات سدیم > کربنات پتاسیم > هیدروکسید سدیم> هیدروکسید پتاسیم در زیر شرایط کاربرد متیل آمین برای کاهش غلظت آفلاتوکسین موجود در انواع محصولات غذایی مشخص شده است: شرایط کاربرد محصول غذایی ماده شیمیایی در یک رکتور متحرک به مدت 2 ساعت و دمای 100 باعث شده آفلاتوکسین از 111به کمتر از 5 کاهش یابد. بادام‌زمینی با 30 درصد رطوبت متیل آمین 25/1 درصد آفلاتوکسین B1 را از 130 به 14 کاهش داده و آفلاتوکسین B2 را حذف کرده است. پنبه دانه متیل آمین 25/1 و 15درصد آب آفلاتوکسین B1 را از 50/28 به 63 رسانده و کل آفلاتوکسین موجود را از 4000 به 65 رسانیده است و کاهش داده است. بادام‌زمینی با 15 درصد رطوبت متیل آمین 25/1 درصد ü انواع اسیدها: اسیدهای مختلف باعث هیدراسیون آفلاتوکسین B1، در محل پیوند اولفینی 9-8 انتهای حلقه فوران می‌شوند. در این وکنش آفلاتوکسین B2a ایجاد می‌شود که سمیت آن آفلاتوکسین B1است. آفلاتوکسین G1 نیز تحت‌تأثیر اسیدها به آفلاتوکسین G2a تبدیل می‌شود. کاربرد اسیدها در فرایند خنثی‌سازی انواع آفلاتوکسین در موادغذایی موجب کاهش کیفیت و ارزش پروتئینی موادغذایی می‌شود و در تجزیه آفلاتوکسین در فرایندهای تهیه موادغذایی کاربردی ندارند (43، 42، 33 و 32).
3-4-4) سایر مواد شیمیایی محلول‌هایی نظیر دی‌متیل آمین هیدروکلراید (5 درصد)، آلدئیدها (فرمالدئید)، پرکسیدبنزوئیل، ید، سولفات، آهن آمونیکی، پرمنگنات پتاسیم و برات سدیم به مقدار قابل توجهی آفلاتوکسین موجود در موادغذایی را کاهش می‌دهد، اما کاربرد این مواد در موادغذایی محدودیت‌هایی دارد زیرا مشکلاتی را نظیر ایمنی و سلامت ماده غذایی ایجاد می‌کنند (43، 42، 33 و 32).
3-4-5) تصفیه یا استخراج آفلاتوکسین به کمک حلال‌ها روش تصفیه یا حذف آفلاتوکسین از موادغذایی بیشتر برای از بین بردن آفلاتوکسین در روغن‌های حاصل از دانه‌های روغنی کاربرد دارد. از آنجا که آفلاتوکسین به صورت خالص در آب و هیدروکربن‌های اشباع، محلول بوده، اما در حلال‌های قطبی نظیر متانول، اتانول، کلروفورم و بنزن محلول می‌باشد، سیستم‌های به کارگیری حلال‌ها، روش مناسبی برای خنثی‌سازی آفلاتوکسین در موادغذایی آلوده و به خصوص دانه‌های روغنی می‌باشد (43، 42، 33 و 32). از جمله حلال‌هایی که بیش از همه توصیه می‌شوند، استون، بنزن و کلروفورم هستند و متانول به صورت مایع نیز نتایج بسیار خوبی را می‌دهد. همچنین استون به همراه 10 درصد وزنی آب کاهش شدیدی در میزان آفلاتوکسین ایجاد می‌کند (43، 42، 33 و 32). حلال‌ها از طریق تغییر ساختمان شیمیایی آفلاتوکسین، تولید یک فرآورده با سمیت کمتر را می‌نمایند. جدول (4-10) سیستم حلال مناسب برای حذف انواع آفلاتوکسین در انواع محصولات کشاورزی را مشخص کرده است. جدول (4-10): حلال‌های مناسب حذف آفلاتوکسین
3-4-6) ویتامین‌ها
الف) ویتامین A بررسی اثر ترکیبات غذایی بر روی خاصیت سرطانزایی آفلاتوکسین‌ها نتایج منطقی و جالبی را مشخص می‌کند، بدین ترتیب که اگر رژیم غذایی از نظر لیپیدها فقیر باشد برای رشد و گسترش سرطان مناسب است. به علاوه آفلاتوکسین B1 می‌تواند آسیب سرطانی در موش‌های که دچار کمبود ویتامین A هستند ایجاد کند اما در موش‌های کنترل شده، این وضع مشاهده نمی‌شود و از آنجایی که ویتامین A جزو ویتامین‌های محلول در چربی می‌باشد این مطلب به طور کاملتری تایید می‌شود. تست‌های تغذیه‌ای به طور واضح نشان می‌دهد که رژیم غذایی می‌تواند در مطالعات طویل‌المدتی که بر روی بروز غدد سرطانی انجام می‌گیرد مؤثر باشد. برطبق بررسی‌های به عمل آمده هسته دی‌هیدروفوران به تنهایی در مولکول آفلاتوکسین خاصیت سرطانزایی ایجاد می‌کند و احتمال دارد که خاصیت سرطانزایی آفلاتوکسین B1 هم مربوط به دلتالکتون غیراشباع و هم به سیستم حلقوی دی‌فوران در ساختمان شیمیایی توکسین باشد (43، 42، 33 و 22).
ب) ویتامین D بررسی‌های انجام شده نشان می‌دهد که مایکوتوکسین‌ها موجب کاهش مقاومت استخوان‌ها می‌شوند که از طریق شکستن آنها قابل اندازه گیری است. همچنین خاصیت ارتجاعی استخوان‌ها را افزایش می‌دهد که این حالت از طریق خم کردن و هنگام شکستن با یک نیروی عملی به کار گرفته شده قابل اندازه گیری است. این روش محاسبه در مورد بیشتر بیماری‌های ساق پا در پرندگان تجربه شده است. آفلاتوکسین‌ها باعث کاهش میزان فسفر و کلسیم سرم خون می‌شوند و ثابت شده است که این کاهش بستگی به جیره غذایی ندارد (43، 42، 33 و 22). آنچه از این مشاهدات می‌توان انتظار داشت، این مطلب است که اثرات سوء آفلاتوکسین‌ها با کمبود ویتامین D رابطه متقابلی دارد.
پ) ویتامین‌های گروه B تیامین و ویتامین‌های گروه B سنتز آفلاتوکسین را تحریک می‌کنند، ولی ریبوفلاوین و پیریدوکسین در این امر دخالتی نداشته و مؤثر نیستند.
ت) ویتامین E ویتامین E به عنوان یک آنتی‌کسیدان، گرچه تأثیر قابل توجهی بر رشد میسلیوم‌های قارچی از خود نشان نمی‌دهد، لیکن در محیطی که از تترکلریدکربن به عنوان عامل محرک تولید آفلاتوکسین استفاده شده باشد نه تنها اثر مهارکنندگی بر تولید آفلاتوکسین نداشته بلکه برعکس در بالاترین غلظت‌های مورد استفاده از ویتامین E در مقایسه با محیطی که فقط شامل تترکلریدکربن بوده است، افزایش قابل توجهی را در تولید آفلاتوکسین نشان داده است (22، 8).
ث) ویتامین C مطالعات بیوشیمیایی اهمیت ویتامین C را در ایجاد سرطان نشان داده است (22). ویتامین C در غلظت‌های متفاوت اثرات گوناگونی را از خود نشان می‌دهد، به طوری که برخی محققین معتقدند که اثر ویتامین C به عنوان یک آنتی‌کسیدان درست مشابه ویتامین E می‌باشد و در محیط‌های حاوی تترکلریدکربن سبب تشدید آفلاتوکسین می‌شود، این در حالی است که تأثیر چندانی بر رشد میسلیوم‌های قارچی ندارد. اما در بررسی انجام شده توسط برخی از دیگر محققین نتایج متفاوتی حاصل شده است.
3-4-7) ترکیبات فنلی ترکیبات فنلی دارای خواص ضدمیکروبی کاملاً شناخته شده‌ای هستند، امروزه دریافته‌اند که این ترکیبات می‌توانند در مهار تولید آفلاتوکسین در محیط‌های آبکی و برخی از سوبستراهای جامد مؤثر واقع شوند. بدین جهت از ارتووانیلین به منظور جلوگیری از تولید آفلاتوکسین در برخی از غلات و دانه‌های روغنی استفاده شده است. در پژوهشی که در همین خصوص انجام شد، 25 گرم از هر یک از دانه‌های زیر از قبیل: برنج (ar.sita)، گندم (8/3 var.s-)، ذرت (2 var.conga-)، بادام‌زمینی (24-12 var.Ak) و خردل (13var.BR-) در ppm 500 محلول آبکی ارتووانیلین به مدت 2 ساعت در یک ارلن مایر 150 میلی‌لیتری خیسانده شدند (دانه‌های کنترل در آب مقطر خیسانده شدند). پس از جدا کردن مقادیر مازاد محلول، تعداد زیادی از دانه‌های روغنی اتوکلاو شدند. روز بعد، دانه‌ها با 5/0 میلی‌لیتر سوسپانسیون اسپور سویة تولیدکنندة آفلاتوکسین، یعنی آسپرژیلوس پارازیتیکوس (3240NARL-) تلقیح شدند. دانه‌های آلوده شده به مدت 7 روز در حرارت 1 28 اینکوباتور و نگهداری شدند. سپس آفلاتوکسین‌ها استخراج شده و به وسیله اسپکتروفتومتر، میزانشان تعیین گردید. به منظور ارزشیابی اثرات ارتووانیلین، درصد جوانه‌زنی دانه‌های روغنی، تعیین شده است که نتایج آن در جدول زیر درج گردیده است. جدول (4-11): درصد اثر مهارکنندگی ارتووانیلین در تولید آفلاتوکسین و جوانه‌زنی جوانه‌زنی تولید آفلاتوکسین دانه‌ها - 63/85 برنج 22/2 18/54 گندم - 27/52 ذرت 24/8 25/76 بادام‌زمینی 56/10 06/51 خردل تولید آفلاتوکسین توسط آسپرژیلوس پارازیتیکوس بر روی غلات و دانه‌های روغنی می‌توان به مقدار قابل توجهی توسط ارتووانیلین مهار و کنترل نمود. مکزیمم اثر بازدارندگی در تولید آفلاتوکسین به ترتیب در برنج و به میزان 6/85، بادام‌زمینی به میزان 25/76 درصد، گندم به میزان 2/54، ذرت به میزان 3/52 و خردل به میزان 1/51 درصد گزارش شده است. بررسی‌ها نشان می‌دهد که خاصیت مهارکنندگی کافئین سبب مقاومت دانه‌های ککائو و قهوه در مقابل آلودگی با آفلاتوکسین بوده و تصور می‌شود که نقش کافئین در این موارد، مشابه عمل یک بازدارنده طبیعی رشد قارچ است. سنتز آفلاتوکسین‌ها در محیط‌های کشت آسپرژیلوس پارازیتیکوس با افزودن 2 میلی‌گرم کافئین به هر میلی‌لیتر از محیط کشت، کاملاً مهار شده است. ظاهراً به نظر می‌رسد که کافئین توسط محدود کردن جذب کربوهیدرات‌ها که توسط کپک به منظور سنتز این گروه از مایکوتوکسین‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد، سنتز آفلاتوکسین را مهار می‌نماید (33، 27، 23، 15 و 14). دهیدروکسی آنیزول بوتیله (BHA)، هیدروکسی تولوئن بوتیله (BHT)، آلفاتوکوفرول (ویتامین E)، اسیدآسکوربیک (ویتامین C)، گلوتاتیون احیا شده و سیستئین که به عنوان آنتی‌کسیدان کاربرد دارند در محیط کشت آسپرژیلوس پارازیتیکوس حاوی تترکلریدکربن که محرک پرقدرتی در سنتز آفلاتوکسین می‌باشد مورد سنجش قرار گرفته‌اند. نتایج این تحقیقات نشان می‌دهد که حضور BHA در محیط به مقدار زیادی سبب مهار تولید آفلاتوکسین می‌شود و اثر مهارکنندگی این ماده با کاهش غلظت، کاهش می‌یابد. برخلاف این ماده، ویتامین E، ویتامین C، گلوتاتیون احیا شده و سیستئین سبب تشدید اثر تحریکی تترکلریدکربن بر تولید آفلاتوکسین می‌شوند. افزودن ترکیبات فوق تأثیر قابل توجهی بر رشد میسلیوم‌های قارچ نمی‌گذارد. پژوهشگران دریافتند که کسیداسیون چربی‌ها نقش مؤثری در بیوسنتز آفلاتوکسین توسط آسپرژیلوس پارازیتیکوس و آسپرژیلوس فلاووس هم در موجود زنده و هم در آزمایشگاه ایفاء می‌کند. در موجود زنده با مشاهده این مطلب که تولید آفلاتوکسین موقعی که آسپرژیلوس پارازیتیکوس و آسپرژیلوس فلاووس روی دانه‌های روغنی رشد می‌کنند، بیشتر از زمانی است که بر روی دانه‌های حاوی نشاسته رشد می‌نمایند. مشخص شده است که بازده آفلاتوکسین به طور مستقیم در ارتباط با عدد پرکسیدی می‌باشد که در عصاره چربی دانه‌ها وجود دارد. تعدادی از محققین نیز نقش سوربات پتاسیم را در حفظ و نگهداری دانه‌های ذرت که حاوی 30، 24 و 18 درصد رطوبت بوده بررسی نموده‌اند. در این آزمایش از کشت خالص آسپرژیلوس پارازیتیکوس NRRL2999 استفاده گردید و سپس رشد میسلیوم، تولید گازکربنیک و مایکوتوکسین اندازه گیری شد. به طور کلی نتایج حاصله نشان داد که تولید دی‌کسیدکربن و مایکوتوکسین با افزایش مقدار سوربات در محیط کاهش می‌یابد. همچنین سوربات پتاسیم بر روی دانه‌های ذرت که حاوی رطوبت کمتری بوده و در داخل ظرف در بسته در حضور غلظت‌های بالای CO2 نگهداری شده بودند، تأثیر بیشتری نشان داد.
3-5) روش‌های بیولوژیکی و میکروبی
در سال 1966، دانشمندان توانستند از میکروارگانیسم‌هایی مانند مخمرها، کپک‌ها، اسپورکپک‌ها، کتینومیست‌ها، بکتری‌ها، خزه و جلبک‌ها جهت از بین بردن آفلاتوکسین، استفاده نمایند. برای مثال یک نوع بکتری به نام فلاوبکتریوم اورانتیکوم (B-184NRRL) می‌تواند سبب تخریب آفلاتوکسین در محیط کشت شود و عمل سم‌زدایی این میکروارگانیسم در محیط شیر، روغن، ذرت، کره بادام‌زمینی، سبوس و بادام، به اثبات رسیده است. در کلیه این آزمایشات مشخص گردیده است که فلاوبکتریوم اورانتیکوم در حرارت 28، به مدت 12 ساعت، قادر است تمامی آفلاتوکسین‌ها را در محیط کشت از بین ببرد. گونه‌های فراوانی از قارچ‌ها در بخش‌های مختلف گیاه بادام‌زمینی حضور دارند که قانون حکم در میان این میکروارگانیسم‌ها، رقابت است. استفاده از آنتی‌بیوتیک aureofungin نیز، گاهی جهت توقف تولید آفلاتوکسین توصیه شده است. اینچنین مشاهداتی زمینه‌ای برای تحقیقات عمیق در مورد استفاده از روش‌های بیولوژیکی که بتواند مواد آلوده به مایکوتوکسین‌ها را سم‌زدایی کند، به وجود می‌آورد. در یک مقیاس صنعتی (یعنی در مقیاس بزرگ و اقتصادی، نه آزمایشگاهی و کوچک) تمام روش‌های فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی که برای بهبود کیفیت بهداشتی غذاهای آلوده به مایکوتوکسین‌ها به کار برده می‌شوند، باید شرایط زیر را داشته باشند (27، 23 و 14). E انجام تمام روش‌ها آسان و ساده باشد و سبب نشود که به بهای اولیه ماده غذایی زیاد افزوده شود. E روش‌هایی را که به کار می‌بریم، نباید سبب مرطوب شدن یک غذای خشک شوند. زیرا علاوه بر اینکه لازم است مجدداً ماده غذایی را خشک کنیم. اشکالاتی در حمل و نقل و انبارداری ماده غذایی نیز ایجاد می‌شود. E روش مورد استفاده نباید ترکیب اصلی را تغییر دهد، چنین تغییری ارزش غذایی و مخصوصاً میزان پروتئین را تغییر خواهد داد. E روش مورد استفاده نباید سبب ایجاد یا باقی ماندن سمی یا سرطانزا شود.
آفلاتوکسیکوز
آفلاتوکسین‌ها گروهی از توکسین‌های قوی هستند که باعث تأثیرات مخرب در سیستم‌های بیولوژیکی می‌شوند. این متابولیت‌ها در پاره‌ای از پستانداران، پرندگان و ماهی‌ها ایجاد سرطان، جهش و ناهنجاری جنینی می‌کنند.
4-1) آفلاتوکسیکوز در انسان به طور کلی آفلاتوکسین‌ها عامل ایجاد نکروز و سیروز حاد کبدی می‌باشند. علائم آفلاتوکسیکوز در پستانداران، از دست دادن اشتها، کمبود وزن، یرقان و تکثیر سریع سلول‌های مجرای صفراوی است (42، 3 و 2). آلودگی حاد به آفلاتوکسین موجب زردی غشای مخاطی، تجمع چربی در کبد و خونریزی می‌شود. گرچه کبد آماج حمله آفلاتوکسیکوز است، اما ضایعات سرطانی در دیگر اندام‌ها به ویژه معده، کلیه، ریه، غدد بزاقی و اشکی و نسج پوست پستانداران زیاد گزارش شده است (42، 3 و 2). شباهت زیادی در اثرات ناشی از استعمال دوزهای مؤثر آفلاتوکسین B1 روی میمون‌گونه و سندرم‌ری در تایلند وجود دارد. این علائم عبارتند از: تب، اسهال، استفراغ، تشنج و اغما که در کودکان و در میمون‌ها کاملاً به هم شباهت دارند. بررسی موادغذایی مورد مصرف کودکان تایلندی، آلودگی شدید آنها را به آفلاتوکسین نشان می‌دهد (42، 3 و 2). تحقیقات زیادی در زمینه رابطه بین میزان آفلاتوکسین موجود در جیره غذایی و بروز سرطان‌های کبدی انجام شده است. در این زمینه با اندازه گیری میزان آفلاتوکسین موجود در غذاهای مصرفی اعم از خریداری شده از بازار و یا نگهداری شده در انبارهای منازل، رابطه مستقیمی بین مصرف آنها با بروز مصرف آفلاتوکسیکوز مزمن به دست آمده است. از بررسی نتایج حاصله می‌توان قبول کرد که هزاران نفر در نقاط مختلف دنیا از آفلاتوکسیکوز ناشی از تغذیه موادغذایی آلوده رنج می‌برند (42، 29، 25، 20 و 19).
معالجه آفلاتوکسیکوز
واضح است که در هنگام مواجه شدن با یک مورد اثبات شده آفلاتوکسیکوز نخستین اقدامی که باید انجام داد تنظیم یک رژیم غذایی متناسب با موازین بهداشتی است که بدین وسیله منشاء اولیه آلودگی برطرف می‌شود. مخلوطی از کولین، اینوزیتول، ویتامین B2 و ویتامین E باعث جلوگیری از ایجاد ضایعات کبدی ناشی از مصرف آفلاتوکسین می‌گردند. باید یادآوری کرد که می‌توان از اثر سمیت آفلاتوکسین به وسیله معالجه پیشگیرانه با فنوباربیتال جلوگیری نمود. فنوباربیتال آفلاتوکسین را به محصولات غیرسرطانزا متابولیزه می‌کند. به کمک استات کورتیزون و دهیدروکورتیزون یک کاهش نسبی در هپاتوم موش صحرایی به دست آمده، اما چنین معالجه‌ای روی کارسینوم‌های ماهی قزل‌آلا اثری نداشته است. آفلاتوکسین B1 می‌تواند آسیب سرطانی در موش‌هایی که دچار کمبود ویتامین A هستند ایجاد کند، اما در موش‌های کنترل شده این وضعیت بروز نمی‌کند. علاوه بر این آفلاتوکسین باعث کاهش در میزان فسفر و کلسیم سرم خون می‌شود و در نتیجه آفلاتوکسین با کمبود ویتامین D اثرات متقابلی دارد. از آنجایی که این دو ویتامین (D, A) از ویتامین‌های محلول در چربی محسوب می‌شوند، بنابراین رژیم غذایی که از نظر لیپیدها ناقص باشد، برای رشد و گسترش سرطان مناسب است. از اینرو می‌توان انتظار داشت که این دو ویتامین در معالجه آفلاتوکسیکوز نقش مؤثری را ایفا کنند.
خواص بیولوژیکی آفلاتوکسین‌ها
6-1) سرطانزایی آفلاتوکسین عوارض ناشی از مصرف آفلاتوکسین‌ها به دو صورت ظاهر می‌شود: الف) پدیده‌های سریع وابسته به خاصیت سمیت ب) پدیده کند مربوط به خاصیت سرطانزایی ممانعت از بروز بیماری‌های نوع اول لزوماً وقوع اثرات ناشی از مصرف طویل‌المدت توکسین را جلوگیری نمی‌کند. اگر مقدار نسبتاً زیادی از محصولات غذایی بادام‌زمینی که با آسپرژیلوس آلوده شده بودند به رژیم غذایی موش‌ها افزوده شود، احتمال بروز تومورهای کبدی، متناسب با غلظت آفلاتوکسین در غذا وجود دارد. جدول (4-16): رابطه بین غلظت آفلاتوکسین تعیین شده توسط فلورسانس و احتمال بروز سرطان کبد در موش غلظت آفلاتوکسین در غذا (mg/kg) دورة آزمایش (روز) احتمال بروز تومورهای کبدی 0/5 370 15/14 5/3 340 15/11 5/3 335 10/7 0/1 323 51/8 2/0 360 10/2 005/0 384 10/0 چنانچه به جای غذای بادام‌زمینی آلوده به آسپرژیلوس فلاووس، آفلاتوکسین به صورت خالص به غذا افزوده شود، نتایج مشابهی حاصل خواهد شد. هرچه حیوان جوانتر باشد، در مقابل خاصیت سرطانزایی توکسین‌ها حساس خواهد بود. ایجاد تومور در حیوانات تازه از شیر گرفته شده، به میزان 5/0-2/0 میلی گرم آفلاتوکسین در هر کیلوگرم رژیم غذایی آنها کفایت می‌کند و اثراتش غیرقابل برگشت است. گزارش شده است که مصرف روزانه 5 میکروگرم آفلاتوکسین، موجب افزایش غددی که رشد غیرعادی دارند نمی‌شود. حتی پس از یک سال به نظر می‌رسد که حیوانات از نظر سلامت عمومی در وضع بسیار خوبی هستند، لیکن باز هم در 60-50% از موش‌هایی که تحت این اثر غذایی قرار گرفته بودند، نهایتاً غدد سرطانی ظاهر شده بود (19، 18، 10 و 9). برخلاف حالت بالا، خوردن 20 میکروگرم آفلاتوکسین در روز، هرچند که در ابتدا هیچ ضایعه‌ای ایجاد نمی‌کند، اما پس از یک سال بر حالت ضعف مزاجی افزوده شده و در 70-60% موارد هم تومورهای بدخیم به وجود می‌اید. بنابراین افزایش در دوز مصرفی روزانه آفلاتوکسین بدون اینکه موجب ظاهر شدن تعداد خیلی بیشتری تومور بشود، در وضعیت کلی سلامتی، تغییراتی را باعث می‌شود. به علاوه با مشاهده یک مورد سرطان در معده موش انسان به این فکر افتاد که آفلاتوکسین، ممکن است ایجاد سرطان‌های مختلفی در اعضایی به جز کبد بکند، (مثلاً ریه‌ها). مسلم است که رژیم غذایی سهم مهمی را در سرطانی شدن به عهده دارد، بدین ترتیب که اگر رژیم غذایی که از نظر لیپیدها ناقص باشد، برای رشد و گسترش سرطان مساعد است. طبق بررسی‌هایی که به عمل آمده مشخص گردیده است که هسته دی‌هیدرودی فوران تنها ترکیب شیمیایی با خاصیت سرطانزایی در مولکول آفلاتوکسین نیست، و ممکن است که، خاصیت سرطانزایی آفلاتوکسین B1 هم به وجود سیستم دی‌هیدرودی فوران و هم به دلتالکتون غیراشباع، بستگی داشته باشد (19، 18، 10 و 9). همچنین ممکن است که آفلاتوکسین B1 تنها یکی سرطانزای مقدماتی باشد و برای اینکه تبدیل به یک ترکیب سرطانزای فعال بشود، لازم است که احتمالاً توسط آنزیم‌های میکروزومی دگرگون گردد (19، 18، 10 و 9).
6-2) اثرات جهش‌زایی آفلاتوکسین B1 موجب انحرافات کروموزم‌ها، شکسته شدن کروموزم‌ها، شکسته شدن کروماتیدها و شکسته شدن DNA در سلول‌های گیاهی و حیوانی می‌شود. اطلاعات حاصل از تست Ames مشخص کرده است که آفلاتوکسین B1 نسبت به سایر آفلاتوکسین‌ها دارای بیشترین فعالیت جهش‌زایی می‌باشد. جدول (4-17) قدرت جهش‌زایی انواع آفلاتوکسین‌ها را در مقایسه با یکدیگر مشخص کرده است (43-42، 33 و 32). همچنین جهش‌زاد بودن آفلاتوکسین B1 در سالمونلاتیفی موریوم 98 TA در مقایسه با سایر انواع آفلاتوکسین و نیز سرطانزا بودن آنها در حیوانات مختلف بررسی شده است که نتایج آن در جدول (4-18) مشخص شده است (43-42، 33 و 32). ارتباط قابل توجهی بین جهش‌زایی بودن و سمیت انواع آفلاتوکسین‌ها وجود دارد که در جدول (4-19) این ارتباط در مقایسه با آفلاتوکسینB1 به تنهایی مشخص گردیده است (42، 32).
6-3) اثرات بیوشیمیایی مطالعات زیادی در حال انجام است تا مکانیزم و راه‌های مختلف اثرات بیوشیمیایی آفلاتوکسین‌ها در هر سطح را در آزمایشگاه و در موجود زنده مشخص نماید. در موجود زنده عمل متقابل توکسین با اجزای متشکله سلولی، به خصوص نوکلئیک اسید و واسطه‌های متابولیسم پروتئین، حائز اهمیت فراوان است. آفلاتوکسین می‌تواند به عنوان یک بازدارنده بیوسنتز مواد عمل کند، به طوری که دوزهای بالای آن باعث بازدارندگی کلی شده و دوزهای کمتر آن به تدریج بر سیستم‌های مختلف اثر می‌کند. همچنین اثر مستمر آفلاتوکسین بر روی سلول‌های کبدی را می‌توان به صورت زیر طبقه‌بندی نمود، به طوری که هر مرحله نتیجه مرحله قبلی باشد (38، 37).
1. عمل متقابل با DNA و ممانعت از عمل پلیمرازهایی که مسئول سنتز DNA و RNA هستند.
2. جلوگیری از سنتز
DNA. 3. جلوگیری از سنتز RNAو بازداشتن RNA پیامبر (mRNA).
4. تغییر دادن مورفولوژی یا شکل هسته.
5. کاهش در بیوسنتز پروتئین.
6-4) اثر متقابل با DNA آفلاتوکسین می‌تواند به DNA متصل شود و در ساختمان مولکولی آن تغییر ایجاد کند. آفلاتوکسین B1 که از لحاظ بیولوژیکی فعال‌ترین نوع آفلاتوکسین است قویتر از آفلاتوکسین‌های G1 و G2 وارد وکنش می‌شود. براساس عمل متقابل آفلاتوکسین با پورین و مشتقات پورینی که به وسیله دستگاه اسپکتروسکپی تعقیب شده است، یک تفاوت اساسی بین آفلاتوکسین و سایر ترکیباتی که با DNA وکنش نشان می‌دهند، این است که آفلاتوکسین با DNA یک رشته‌ای هم می‌تواند وارد عمل متقابل شود. معهذا اتصال با DNA آنچنان ضعیف است که عبور از یک ستون کروماتوگرافی به سادگی کمپلکس را از هم جدا می‌کند. این عمل متقابل می‌تواند ممانعت از سنتز DNA و RNA را به طور همزمان توسط آفلاتوکسین توضیح دهد.
6-5) جلوگیری از سنتز DNA ممانعت از بیوسنتز اسیدنوکلئیک می‌تواند به علت غیرفعال کردن سیستم‌های سازنده آنزیم باشد، و یا ممکن است به این خاطر باشد که مولکولی‌های DNA ایی که در سلول‌های صدمه دیده وجود دارند دیگر نمی‌توانند مدل خوبی برای همانندسازی باشند. این ضعف همانندسازی DNA تحت‌تأثیر آفلاتوکسین، با عمل کتینومایسین قابل مقایسه است (به خصوص که ساختمان این دو مولکول از بعضی جنبه‌ها مشترک است). کتینومایسین به درون زنجیر مارپیچی دوگانه DNA نفوذ کرده و در جایگاهی که حاوی گوانین است جای می‌گیرد. در حالیکه آدنین و تیمین به صورت تغییر نیافته باقی می‌مانند. مطالعات دقیقی در مورد عملکرد آفلاتوکسین B1 بر روی متابولیسم کبد به عمل آمده است که طی آن از برداشت بافت کبد برای تحریک سنتز استفاده شده است. چنانچه یک برداشت کبدی جزئی در فرد سالم انجام شود، پُرسازی جبرانی حاصل خواهد شد که این فرایندی است که توسط آفلاتوکسین از آن ممانعت می‌شود. اگر 60-30 میکروگرم در روز توکسین در طی پنج روز قبل از عمل جراحی برداشتن از جگر تزریق شود، حیوان تا 24 ساعت پس از جراحی تلف خواهد شد که این نشانه بارزی است از نقش آفلاتوکسین در جلوگیری از سنتز DNA می‌باشد.
6-6) کاهش سنتز RNA آفلاتوکسین‌ها به وسیله عمل متقابل و وکنش با DNA می‌توانند از نسخه‌برداری DNA توسط RNA پلیمراز ممانعت کرده و بدین صورت از بیوسنتز RNA نیز جلوگیری نمایند (13). فعالیت RNA سیتوپلاسمی به کل متوقف می‌شود در حالیکه این حالت در مورد RNA هسته‌ای خفیف‌تر است. فعالیت RNA هسته‌ای در مراحل اولیه کاهش پیدا می‌کند و بعد از 15 دقیقه تماس با آفلاتوکسین، بیوسنتز، به میزان 95-90% متوقف می‌شود. نتایج آزمایشات بر روی موجودات زنده و بر روی سلول‌های کبدی موش نسبت به بررسی‌های آزمایشگاهی بر روی سلول‌های موجود در کشتی از بافت‌های انسانی (به عنوان مثال سلول‌های کلیوی Helas3 و T یا سلول‌های chang کبد) سریعتر به دست می‌اید. این پدیده در دوزهای کم (mg/kg1-5/0) بازگشت‌پذیر است و فرایندهای بیوسنتزی مختلف طبق نظم زیر مجدداً شروع می‌شود: پس از 24 ساعت سنتز کلی RNA هسته‌ای، سپس سنتز RNA هستک، و پس از 48 ساعت سنتز DNA از سر گرفته می‌شود.
6-7) کاهش در بیوسنتز پروتئین قابلیت ممانعت‌کنندگی آفلاتوکسین B1از سنتز پروتئین‌ها از سرعت و میزان اثر ممانعت‌کنندگی آن از سنتز DNA و RNA است (جدول 4-20). بعد از نشاندار کردن اسیدآمینه لوسین مشخص شده که پس از 3 تا 8 ساعت مصرف دوزهای خورکی آفلاتوکسین B1 به میزان mg/kg3، 60 درصد سنتز پروتئین در سلول‌های کبد موش متوقف گردیده است (32). همچنین در بررسی میمون به صورت آزمایشگاهی بعد از 130-5/3 ساعت مصرف mg/kg2 آفلاتوکسین B1، 45 درصد سنتز پروتئین در سلول‌های کبد متوقف شده است و تزریق صفاقی mg/kg60 آفلاتوکسین B1 به جگر موش موجب شده است که 30 درصد از سنتز پروتئین بعد از گذشت 1 ساعت متوقف گردد. اثر ممانعت‌کنندگی آفلاتوکسین B1 و تقلیل بیوسنتز پروتئین‌ها تحت‌تأثیر دو عمل صورت می‌پذیرد (42 و 32): E برهم خوردن نظم پلی‌ریبوزم‌ها. E ایجاد ریبوزم‌های مارپیچی. برهم خوردن نظم پلی‌ریبوزم‌ها بعد از استفاده از آفلاتوکسین B1 در کبد موش، سنجاب، میمون و کشت سلول‌های کشت داده شده و بررسی بافت‌ها مشاهده گردیده که 70 درصد پلی‌زوم‌هایی که درمعرض mg/kg5/1 دوز تزریق صفاقی آفلاتوکسین B1 بوده‌اند بعد از 18 ساعت، تبدیل به مونوزم‌ها شده‌اند. همچنین وقتی کبد موش در معرض mg/kg15 آفلاتوکسین B1 به صورت تزریق صفاقی قرار گرفت بعد از 7 روز، 50 درصد پلی‌زوم‌هایش تبدیل به مونوزم شد. ایجاد ریبوزم‌های مارپیچی حضور پلی‌ریبوزم مارپیچی بعد از تزریق mg/kg1 آفلاتوکسین B1 به جگر و کلیه سنجاب و موش، پس از گذشت 15 دقیقه از تزریق با میکروسکوپ الکترونی تایید شده است. هر مارپیچ ریبوزم دارای 30-25 ریبوزم بوده که با زاویه o 70-60 نسبت به یکدیگر قرار گرفته‌اند و مانع از کارکرد صحیح mRNA می‌شوند. آفلاتوکسین M1 و G1 نیز مانع از سنتز پروتئین‌ها در جگر و کلیه سنجاب می‌شوند. اما اثر آنها در ممانعت‌کنندگی سنتز پروتئین به اندازه آفلاتوکسین B1 نمی‌باشد. سنتز پروتئین‌های پلاسما «آلبومین، فیبرونوژن، آلفا-2 گلبولین، و آلفا اسیدگلیکو پروتیئن» بعد از اضافه کردن مقادیر g100/g 1000-125 آفلاتوکسین B1، ظرف 4-2 ساعت متوقف شده است (42 و 32).
6-8) ممانعت از سنتز چربی‌ها در بررسی آزمایشگاهی و بافتی مشخص شده که آفلاتوکسین B1 مانع از سنتز لیپیدها می‌گردد، و از ورود پارافسفات به داخل فسفولیپیدهای جگر و استات به داخل چربی‌های جگر ممانعت می‌کند. آفلاتوکسین B1 همچنین مانع از ورود استات به داخل تری‌گلسیریدها، اسیدهای چرب، کلسترول و استرکلسترول جگر می‌شود و مصرف mg/kg5-2 آفلاتوکسین به شکل تزریق صفاقی موجب شده که سنتز کلسترول در جگر سنجاب به طور کامل متوقف گردد (42 و 32). جدول (4-20) تأثیر غلظت آفلاتوکسین B1 بر مقدار سنتز RNA, DNA و پروتئین توسط فلاوبکتریوم آرنتیکوم، ارقام داده شده بیانگر میانگینی حاصله از افزایش مقدار آفلاتوکسین B1 و میزان سنتز RNA, DNA و پروتئین در 10 میلی گرم از محیط کشت حاوی بکتری پس از 4 دوره اینکوباسیون در مقایسه با مقدار سنتز RNA, DNA و پروتئین نمونه شاهد که فاقد آفلاتوکسین B1 بوده، می‌باشد. B1 (Mg/1) DNA (Mg) RNA (Mg) پروتئین (Mg) 0 33 70 190 10 27 60 190 25 21 60 180 50 0 60 170 100 - 50 165 6-9) ذخیره آفلاتوکسین در بافت‌ها در کالبد شکافی از بافت‌های اجساد 23 کودک مبتلا به آنسفالوپاتی دژنراسیون چربی در اثرپ مصرف آفلاتوکسین B2 دیده شده که مقدار این توکسین در کبد برابر mg/kg 093/0، در مدفوع 123/0 میلی گرم در کیلوگرم، در معده mg/kg127/0 و در صفرا mg/lit08/0 بوده است. نمونه‌های ادرار 51 کودک مبتلا به بیماری فوق مورد مطالعه قرار گرفته است. در 8 نمونه از ادرار آنها آفلاتوکسین B1 مشاهده شده است. در حالیکه از تجزیه ادرار 23 کودک سالم حضور هیچگونه آفلاتوکسینی گزارش نشده است، که دلیل عدم تماس قبلی این کودکان با آفلاتوکسین می‌باشد. ذخیره شدن آفلاتوکسین در بافت‌های بدن میمون هم شبیه انسان است. آفلاتوکسین در مغز، کبد، کلیه، قلب و صفرای بعضی از حیوانات، حداقل 2 روز و حدکثر 3 روز باقی می‌ماند.
روش‌های تشخیص، تخلیص و شناسایی آفلاتوکسین‌ها
کثر، متدهای استخراج، تشخیص و شناسایی آفلاتوکسین‌ها، براساس قابلیت انحلال آفلاتوکسین‌ها در حلال‌های قطبی مانند کلروفرم، متانول، اتانول، استون، بنزن و غیرقابل نامحلول بودن آنها در حلال‌های غیرقطبی (لیپیدی)، مانند هگزان، اتردوپترول و دی‌اتیل‌اتر، صورت می‌گیرد. استخراج چربی در نمونه‌های مورد آزمایش هنگامی ضروری است که بیش از 20% چربی در ماده مورد وجود داشته باشد. این چربی‌ها می‌تواند، یا به وسیله اتردوپترول و یا پاپنتان، و یا با استفاده از هگزان در دکانتور، در حالیکه خوب تکان داده می‌شود، استخراج گردد. سپس عصاره استخراج شده با آب مقطر، رقیق می‌گردد و به وسیله کلروفوم استخراج می‌شود و فاز محلول در کلروفوم لایه‌ای جداگانه‌ای را تشکیل می‌دهد. پس از جدا شدن حلال، باقیمانده آن را در مخلوطی از پترولیوم اتر، متانول و آب، حل کرده و با تکان‌های شدید آن را جدا می‌کنند. سپس فاز زیرین (متانول) را به وسیله اتردوپترول دوباره شستشو داده و تحت فشار کم تبخیر می‌کنند. روش خالص‌سازی آفلاتوکسین‌ها به وسیله کروماتوگرافی لایه نازک صوت می‌گیرد اگر صفحه را درمعرض اشعه ماورای بنفش قرار دهند ظهور یک نقطه فلورسانس آبی، زیر امواج بلند ماورای بنفش دال بر وجود آفلاتوکسین می‌باشد، در واقع آفلاتوکسین‌ها وقتی در معرض نور ماورای بنفش با طول موج بالا قرار گیرند، دارای خاصیت فلورسانس شدیدتری هستند. این خاصیت موجب می‌شود که این ترکیبات حتی در مقادیر بسیار جزئی (5/0 نانوگرم یا کمتر در نقطه) ngr/spot 5/0 مشخص شوند.
7-1) جداسازی و تشخیص آفلاتوکسین‌ها به روش T.L.C روش کروماتوگرافی لایه نازک یا T.L.C به علت سرعت عمل، حساسیت و سادگی کار، در اکثر آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این روش انتخاب نوع ماده جاذب از اهمیت خاصی برخوردار است و معمولاً سیلیکاژل همراه با گچ در لایه‌های نازک به ضخامت 25/0-5/0 میلی متر مورد استفاده قرار می‌گیرد. حلال‌های رایج مورد استفاده جهت جداسازی آفلاتوکسین‌های مورد آزمایش عبارتند از: (24) کلروفوم/متانول (93:7 تا 99:1) کلروفوم/استون (85:15 تا 90:10) کلروفوم/استون/اتانول (10:1: 89) متانول/آب/اتر (150:25:825) بنزن/اتانول/آب (1:96: 3) معمولاً عمل تبخیر برحسب درجه حرارت و حلال مورد استفاده از 45 دقیقه تا 3 ساعت متغیر است. در این روش با اندازه گیری RF استاندارد، نمونه مورد آزمایش تشخیص داده می‌شود.
7-2) تشخیص و شناسایی آفلاتوکسین به روش گاز کروماتوگرافی ـ اسپکترومتری جرم (G.C.M) شناسایی آفلاتوکسین به کمک روش گاز کروماتوگرافی ـ اسپکترومتری جرم، یک روش سریع برای آفلاتوکسین‌های B1 و B2 می‌باشد که در این روش، تشخیص به کمک بمباران الکترونی و شناسایی یون انتخابی صورت می‌گیرد. در این روش ابتدا عصاره را خالص نموده و سپس به داخل ستون مخصوص تزریق می‌شود. حد تشخیص این روش برای آفلاتوکسین‌های B1 و B2 ppb 1/0 می‌باشد.
7-3) تشخیص و شناسایی آفلاتوکسین با روش کروماتوگرافی مایع با کارکرد بالا (HPLC) در روش HPLC ابتدا به کمک روش‌های شیمیایی، مشتقات آفلاتوکسین‌های مورد بررسی را تهیه می‌نمایند. این عمل بدین منظور صورت می‌گیرد تا قدرت تشخیص، حساسیت و میزان انتخابی و اختصاصی بودن روش افزایش پیدا کند. برای مثال، آفلاتوکسین‌های B1 و G1 به کمک مخلوط اسیدتری فلورواستیک و آب به همی‌استال‌های B2 و G2 که خاصیت فلورسانس بیشتری دارند، تبدیل می‌شود و سپس این مشتقات به وسیله کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس جدا شده و تفکیک می‌گردد. این روش در مقایسه با سایر روش‌ها قابل اطمینان‌ترین و معمول‌ترین روش استفاده برای آنالیز و شناسایی آفلاتوکسین‌ها می‌باشد که به عنوان یک روش استاندارد و برتر در مقابل سایر روش‌های جدید، شناخته شده است
دیدگاه ها